Электрофорез гемоглобина что это
Электрофорез гемоглобина что это
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов): 2α и 2β, каждая из которых связана с гемом. Гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Посредством электрофореза гемоглобина можно проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Синонимы английские
Serum Hemoglobin Electrophoresis.
Электрофорез и денситометрия.
Мг/дл (миллиграмм на децилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Нарушения структуры гемоглобина обычно разделяют на две группы: гемоглобинопатии и талассемии, хотя талассемии являются формой гемоглобинопатии. Талассемии представляют собой нарушения синтеза α-, β- или обеих цепей гемоглобина. Также могут отмечаться нарушения синтеза δ-, γ- цепей. Большинство вариантов α- и β-талассемий сопровождается изменением уровня HbF и HbA2, поэтому определение этих изоформ может быть использовано для скрининга этих состояний.
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Электрофорез является чувствительным методом, с помощью которого можно исключить гемоглобинопатии либо определить тактику дальнейшего обследования для установления точного диагноза заболевания. Метод характеризуется высокой внутрипостановочной (SD Когда назначается исследование?
Электрофорез гемоглобина что это
Крупнейшее событие в ходе эволюции нашей планеты – открытие процесса фотосинтеза – повлекло за собой неизбежное изменение состава земной атмосферы в плане увеличения доли молекулярного кислорода. Появление такого эффективного биологического окислителя, как О2, дало гетеротрофным организмам возможность более эффективного извлечения энергии органических связей путем дыхания. Последовавшее затем возникновение крупных многоклеточных привело к проблеме транспорта кислорода в ткани биологических систем. Но, поскольку кислород очень плохо растворим в воде (всего 4,9 мл газа в 100 мл Н2О), очевидным решением этой проблемы стало появление гуморальных посредников, доставляющих дыхательные газы по адресу. Таким образом, в ходе эволюционного прогресса у большинства многоклеточных сформировалась система белковых дыхательных пигментов, главным из которых является гемоглобин (Hb) [1–3].
Гемоглобин (Hb) (от греч. haemo – кровь и лат. globus – шар), красный железосодержащий хромопротеин, обнаруженный у всех эукариотических организмов, от одноклеточных (дрожжи и др.) до беспозвоночных и высших позвоночных животных. Он способен обратимо связывать молекулярный кислород в количестве 20 мг О2, на 100 мл крови [4]. В биологических системах Hb выполняет две важнейшие функции: а) транспорт дыхательных газов; б) поддержание кислотно-основного равновесия (стоит заметить, что гемоглобиновый буфер является самым мощным в организме (примерно 3/4 от общей буферной емкости крови) [5].
Гемоглобин называют модельным белком, свойства, функции и структура которого наиболее полно изучены по сравнению с другими протеинами человека. Отмечая ключевую роль этого хромопротеина в системе дыхания, непревзойденный гемоглобинолог Макс Перутц назвал Hb «молекулярным легким» [6].
Гемоглобин – внутриклеточный компонент. На его долю приходится 90 % всего белка красных кровяных телец. Примечательно, что в собственном метаболизме эритроцита кислород не используется [7]. Молекулярная масса большинства изотипов этого пигмента колеблется в пределах 64,5–68 кД. Размер – 6,8 нм. pI – 6,8. Первичная структура характеризуется высоким содержанием гистидина [4, 8].
Все типы гемоглобина являются тетрамерами, построенными из пары α-субъединиц, и специфической для каждого типа иной пары. Каждый из четырех протомеров построен из двух неравных частей: небелковая структура – гем (4 % массы молекулы Hb, обеспечивает окраску и ковалентную связь с кислородом) и белковая глобула – глобин (96 % массы, чаще представлен либо 141 (α-цепь), либо 146 (β-, γ-, δ-цепи) аминокислотными остатками) [4, 8].
Комплекс, составленный из одной глобиновой субъединицы и одного гема, называется Сведберговой единицей. Таким образом, молекула Hb построена из четырех Сведберговых единиц, слабо связанных между собой нековалентными связями (гидрофобными, электростатическими, водородными) [8].
Синтез гема происходит в митохондриях. Глобин, как и любой белок, синтезируется на рибосомах. Их объединение в мультимер осуществляется в фазу созревания полихроматофильного нормобласта [9].
Лигандом молекулы гемоглобина, присоединяющим кислород, является ион Fe2+. Это взаимодействие обратимо и зависит от парциального давления O2. В артериальной крови практически весь Hb (95–98 %) связан с кислородом. В венозной крови содержание оксигемоглобина составляет 67–75 %, остальная часть приходится на долю свободного (редуцированного) Hb [1, 4, 5].
Норма общего Hb в крови у мужчин составляет 135–170 г/л, у женщин – 120–150 г/л [10].
В крови у новорожденного содержится 140–190 г/л этого белка, но к концу первого месяца его уровень снижается до нормального для взрослого. Динамика средней концентрации Hb крови в период от рождения до 12 лет представлена в таблице [9].
Средние уровни Hb в крови в раннем постнатальном периоде
В плане градации Hb выделяют:
? нормальные формы: восстановленный (редуцированный) Hb, оксигенированный Hb, карбгемоглобин и метгемоглобин.
? производные: карбоксигемоглобин, сульфгемоглобин, метгемоглобин, циангемоглобин и др.
? типы (изотипы) – принципиально различные подвиды Hb, кодирующиеся отдельными генами, различающиеся строением протомеров глобина. Очевидно, гемоглобины разных типов отличаются первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами [10].
К основным типам гемоглобина человека относятся следующие:
? HbА1 – является преобладающим в крови взрослого (98 % от общего Hb). Тетрамер, его молекула построена из двух α- и двух β-субъединиц (141 и 146 аминокислотных остатков соответственно). Его синтез начинается уже на 6–8 неделях гестации и продолжается до конца жизни [8, 11].
? HbА2 (минорный, 2 α- и 2δ-протомера). Его концентрация в крови взрослого 1,5–3,5 % от общего Hb. Уровень этого изотипа возрастает при гипохромных и мегалобластных анемиях, серповидноклеточной анемии, β-талассемии. Снижение его концентрации в крови отмечается при δ-талассемии, гемоглобинопатии Н, эритролейкозе [8, 9, 11].
? Примитивный (эмбриональный) Hb (HbР). Обладает более высокой (чем HbA1) тропностью к О2. Является самым ранним гемоглобином эмбриона. Синтезируется в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед) в желточном мешке [8, 11].
? Плодовый (фетальный) гемоглобин (HbF, тетрамер, 2 α- и 2 γ-цепи). Его продукция начинается с 12-й недели внутриутробного развития, и к 6 месяцам полностью замещает HbP в крови. К моменту рождения концентрация HbF составляет 55–85 % от общего. В крови взрослого человека его доля составляет 1,5 % от общего Hb [8, 11].
a-, b-, g- и d-гены гемоглобина расположены на коротких плечах 11-й и 16-й хромосом [11, 12].
Известно около 200 патологических типов Hb, причиной возникновения которых являются мутации. Данные протеины регистрируются в крови человека при состояниях, называемых гемоглобинопатиями (M Hyde Parc, Bristol, Sydney и др.) [13–15].
По причине стремительного прогресса биохимических методик индикации, в последние годы роль отдельных типов гемоглобина, как диагностических и прогностических маркеров, приобретает все большее прикладное значение.
Особо следует сказать о методологии количественного определения гемоглобинов. В большинстве стран в качестве общепринятых применяются колориметрические методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного общества по гематологии (1964), среди которых доминирующим является унифицированный гемоглобинцианидный метод. Оптические способы обнаружения гемоглобинов практичны, доступны и просты, но имеют существенный недостаток: они имеют низкую селективность, не позволяющую регистрировать отдельные типы гемоглобина [9, 10].
Существуют также методики лабораторного количественного анализа гемоглобинов путем электрофореза в агарозе, крахмальном геле, ацетате целлюлозы и др. Но они является полуселективными, так как определяют только фракции гемоглобинов со сходной электрофоретической подвижностью, а не индивидуальные типы этого белка [10].
В последние десятилетия в медицинской практике наблюдается тенденция перехода от регистрации фракций веществ (общий белок, общий гемоглобин и др.) к определению отдельных форм вещества. Такой подход повышает качество диагностики и прогностической оценки. Очевидно, медицина XXI века нуждается в принципиально новых технологиях тестирования гемоглобинового профиля по каждому из основных его изотипов [16].
Наиболее адекватно отвечают вышеуказанным требованиям уже давно известные иммунохимические методы определения белков (ИФА, иммунофлюоресценция, иммуноблоттинг, методика Манчини и др.). Они до сих пор остаются максимально специфичными, точными, чувствительными и надежными [10, 16].
Попытки моделирования иммунохимических методов количественного анализа некоторых фракций гемоглобинового профиля предпринимались еще с начала прошлого столетия. В данных работах исследователи исходили из убеждения, что разработка и внедрение в клиническую диагностику иммунохимических диагностических тест-систем на значимые типы гемоглобина целесообразно и актуально, так как значительно оптимизирует и облегчит лабораторную оценку статуса красной крови. В дальнейшем научный интерес в этом направлении был снижен вследствие внедрения в международную клиническую практику оптических циангемоглобиновых методов индикации. Но в последние десятилетия, в связи с усовершенствованием иммунохимических методик и ростом научного интереса к отдельным компонентам гемоглобинового спектра с одной стороны, ростом потребности в специфических диагностических тестах на конкретные типы этого протеина, с другой стороны, отмечается активизация работы немногочисленных научных групп по разработке и внедрению в медицинскую практику новых, современных иммунохимических тест-систем на различные генотипы гемоглобина человека [17–19].
Определение количества Hb в крови имеет большое клиническое значение. Снижение его концентрации отмечается при анемиях различной этиологии. Повышение Hb крови может быть как физиологическим, так и патологическим. Умеренные повышения встречаются при гемолитических анемиях, анемии Кули, гемоглобинозе С и др. Значительные увеличения встречаются при всех гемоглобинуриях [4, 8, 20].
Существует множество нозологических форм, при которых имеет важное значение не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов, изменение соотношения которых в клинической практике используют для диагностики различных патологических состояний [8, 21–23].
Например, при снижении скорости синтеза α-цепей возникает α-талассемия. При возникновении мутаций в β-гене нарушается синтез β-полипептидной цепи, возникает β-талассемия, что приводит к образованию повышенных количеств HbF. Талассемии сопровождаются анемиями, которые могут принимать очень тяжелые формы. Увеличение количества HbF наблюдается также при гомозиготной форме β-талассемии, наследственном персистировании фетального гемоглобина, σ-, β-талассемии, серповидно-клеточной анемии [1, 24].
Увеличение пропорции HbF при рождении наблюдается у недоношенных, у новорожденных, подвергавшихся хронической внутриматочной гипоксии, а также у новорожденных, родившихся у женщих с поздними гестозами (в частности – с нефропатией), гипертонической болезнью, эндокринными нарушениями, интоксикациями, сердечно-сосудистой патологией, гематологическими заболеваниями. Уменьшенные уровни HbF обнаружены у новорожденных с синдромом Дауна [25–27]. Повышение уровня плодового гемоглобина отмечается при преждевременной отслойке плаценты, угрозе прерывания беременности [18, 21]. Значительное снижение уровня этого белка регистрируется у больных с различными типами эритробластозов [2, 16]. Показано снижение концентрации HbF в крови пациентов с лимфогранулематозом, сфероцитарной гемолитической анемией, тромбоцитопенической пурпурой [20, 28].
Литературные данные последних лет, основанные именно на иммунохимических методах определения плодового и примитивного гемоглобинов, свидетельствуют, что значение селективной индикации этих протеинов как диагностических маркеров представляет значительно больший прикладной интерес, чем считалось ранее. Показан рост продукции HbF при хронических гипоксиях различного генеза [26, 29]. Сходный компенсаторно-адаптивный рост концентрации этого белка отмечается у людей, проживающих в условиях высокогорья [25]. Значительное повышение продукции плодового гемоглобина отмечено при тяжелых формах героиновой наркомании [30].
Следует отметить, что до применения иммунохимических методов индикации сведения о прикладном значении примитивного гемоглобина как клинико-диагностического маркера были крайне скудны. На наш взгляд, это объяснялось тем, что (как считалось прежде) продукция HbP полностью ингибирована как у детей, так и у взрослых, что не вызывало интереса к данному белку как диагностическому маркеру [4, 9]. Однако, как показали исследования последних лет, основанные на внедрении иммунохимических методик, статистически значимое повышение концентраций примитивного и плодового гемоглобинов в крови регистрируется при некоторых онкологических заболеваниях красной крови (эритремия, сублейкемический миелоз, острый и хронический лимфолейкоз), что свидетельствует о высоком диагностическом значении этих протеинов как канцероэмбриональных антигенов [17, 31]. Достоверный рост уровня HbF и появление в крови HbP наблюдается при тяжелых гипоксических состояниях новорожденных, сопровождающихся задержкой внутриутробного развития или гемолитической болезнью [29, 32].