Фибробласты что это такое в косметологии лица
SPRS-терапия
Единственная одобренная в России технология коррекции возрастных изменений кожи, основанная на применении собственных культивированных фибробластов.
SPRS-терапия — уникальная программа клеточного омоложения кожи, основанная на использовании собственных фибробластов человека. Фибробласты — специализированные клетки молодости кожи, золотой запас её здоровья и красоты. Именно они синтезируют эластин, коллаген и гиалуроновую кислоту — самые важные компоненты, которые делают кожу упругой, гладкой, увлажнённой — молодой.
Возрастные изменения кожи связаны с тем, что со временем фибробластов, выполняющих в ней свои важные функции, становится значительно меньше. Снижаются процессы обновления компонентов, синтезируемых этими клетками, кожа теряет упругость и эластичность, растягивается, меняется её цвет, формируются стойкие заломы и морщины.
Процедуры косметологии во многом помогают продлить молодость: они направлены на принудительную стимуляцию выработки в коже коллагена, заставляя тем самым фибробласты усиленно работать. Но поскольку с возрастом возможности этих клеток ослабевают, то постепенно ответ на косметологические процедуры становится всё слабее, а бороться с увяданием кожи — всё сложнее. Ей просто не хватает внутренних сил отвечать на инъекции, лазерные процедуры и другие способы активации регенеративной функции.
Специалисты клиники косметологии «МЕДИ на Невском» первыми в Санкт-Петербурге представили инновационную SPRS-технологию при содействии Института стволовых клеток человека (г. Москва). Клиника МЕДИ на данный момент является единственным партнером Института стволовых клеток человека в Санкт-Петербурге.
Уникальность SPRS-терапии защищена российскими и международными патентами. Основная технология «Применение аутологичных дермальных фибробластов для коррекции возрастных и рубцовых дефектов кожи» имеет разрешение Росздравнадзора на применение (ФС№ 200 9/308), выданное Институту стволовых клеток человека в июле 2010 года — единственной организации, имеющей официальное разрешение на применение данной технологии в России.
За год наблюдения результатов клеточного омоложения кожи фибробластами косметологи-дерматологи МЕДИ сформировали обширную клиническую базу и продолжают отмечать позитивную динамику, подтверждающую эффективность процедур SPRS-терапии. Специалисты МЕДИ тесно сотрудничают с авторами технологии, обмениваются опытом и совместно рассматривают нестандартные клинические случаи.
Комплекс процедур SPRS-терапии позволяет выделить из маленького (4 мм) участка кожи пациента любого возраста его собственные фибробласты, изучить их морфо-функциональные особенности (на основании чего составляются «Паспорт кожиТМ» и индивидуальная SPRS-программа), нарастить данные клетки в необходимом количестве для проведения терапии и создать криобанк собственных фибробластов пациента на будущее.
Кому рекомендована SPRS-терапия
Восполнение численности фибробластов в коже позволяет если не остановить её увядание, то значительно его замедлить. Привнесенные в кожу клетки со свежими силами принимаются за создание прочного коллагенового/эластинового каркаса, как следствие — улучшаются обменные процессы в тканях кожи, восстанавливается её внутренняя структура.
Результаты клеточного омоложения кожи
SPRS-терапия эффективна как для женщин, так и для мужчин. После введения фибробластов уже спустя месяц можно отметить первые позитивные изменения состояния кожи: она как будто наполняется новыми силами, выравнивается её цвет, улучшаются текстура и упругость, нормализуется увлажнённость. Постепенно эффект нарастает, и по прошествии года, в течение которого привнесённые фибробласты полностью сформируют вокруг себя обновлённую среду, можно оценить окончательный результат: повышение плотности кожи (в среднем на 64%), увеличение её упругости и эластичности, уменьшение количества и глубины морщин. Эффект сохраняется в течение нескольких лет.
Заметно улучшается реакция кожи и на интенсивные лифтинговые процедуры: лазерное омоложение и шлифовку, SMOOTH, RF-омоложение, фотоомоложение IPL. Возможно достижение выраженной подтяжки тканей даже в тех случаях, когда без введения фибробластов эффективным могло быть только хирургическое вмешательство.
Осуществить забор материала для выделения фибробластов возможно в любом возрасте (с момента совершеннолетия), при этом независимо от возраста пациента активность культивированных фибробластов сохраняется на одинаково высоком уровне. Проводить клеточное омоложение обычно рекомендуется с 30 лет и старше.
В ходе первого курса процедур клинически обосновано (для достижения эффекта) введение не менее 120 миллионов культивированных фибробластов. Делается это за 1 или 2 процедуры (по желанию пациента). Указанная доза применяется для омоложения кожи лица, или шеи, или декольте, или кистей рук.
Безопасность SPRS-терапии
Методика SPRS-терапии более 10 лет находится под тщательным клиническим контролем и получила максимальную оценку уровня безопасности, которая обеспечивается на всех этапах: от забора биоптата до процедуры введения фибробластов в кожу пациента. Клетки проходят несколько степеней очистки от посторонних белков и далее выращиваются в специальных средах при строгом соблюдении специфических условий.
Клеточный материал проходит обязательное тестирование как в процессе выращивания клеток, так и после извлечения их из криобанка для проведения процедуры. Это гарантия того, что в кожу будут введены именно те фибробласты, которые обладают высокой жизнеспособностью и функциональной активностью. Сами клетки генетически принадлежат пациенту, поэтому идеально адаптируются в коже и не вызывают аллергической реакции.
Результат SPRS-терапии всегда положителен: восстановление регенеративной способности кожи, а значит — сохранение её здоровья и продление молодости.
SPRS-терапия
Создание банка собственных клеток-фибробластов в Институте стволовых клеток.
Клеточное омоложение собственными клетками кожи уже доступно в Эстетик Клуб!
Стоимость процедур
SPRS-терапия – омоложение собственными фибробластами кожи
Наблюдая на лице признаки старения, так хочется повернуть время вспять и снова ощутить нежность кожи, увидеть легкий румянец, убрать морщины и почувствовать ее приятную упругость. Инновационная методика, «технология будущего, которое возможно уже сейчас» – так отзываются врачи всего мира о клеточном омоложении SPRS. Именно эта процедура, в отличие от всех остальных методик, действительно позволяет полностью обновить кожу до состояния молодой, восстановить ее тонус, текстуру и здоровый цвет лица.
SPRS терапия (Service for Personal Regeneration of Skin) – в переводе с английского языка означает «процедура омоложения собственными клетками кожи». Комплекс лечебно-диагностических мероприятий, которые позволяют реструктуризировать кожу путем выращивания собственных фибробластов. Клеточное омоложение SPRS – это единственная клеточная технология в России, одобренная Министерством здравоохранения РФ. Эстетик Клуб аккредитован Институтом стволовых клеток человека для выполнения SPRS терапии в Санкт-Петербурге.
Процесс старения кожи обусловлен катастрофическим снижением количества фибробластов. Фибробласты – клетки, которые вырабатывают необходимые для молодости нашей кожи компоненты соединительной ткани: коллаген, эластин, гиалуроновую кислоту. Альтернативные методики улучшают условия, в которых находятся фибробласты, активизируют работу этих клеток, но, в отличие от SPRS терапии не добавляют их количество. Беспрецедентный эффект SPRS терапии – это полная реструктуризация кожи и ее обновление на биологическом уровне, которое приводит к улучшению ее рельефа, текстуры и цвета.
Как выполняется процедура
Методика SPRS терапии состоит из нескольких этапов:
Суспензия для SPRS доставляется строго к определенному времени проведения процедуры, а сами инъекции выполняются тончайшими иглами однократно. При необходимости и по желанию процедуру можно повторить через 1 год.
Показания и противопоказания
Естественные возрастные изменения, сниженный ответ на альтернативные эстетические методики, необходимость быстрого восстановления после агрессивных косметологических процедур (пилинги, шлифовки) или после пластических операций – все это показания для SPRS терапии. С помощью клеточного омоложения можно существенно замедлить процессы старения кожи, а также создать и надолго сохранить запас собственного «эликсира молодости», эффективность которого несравнима с другими процедурами.
Среди противопоказаний – заболевания крови, онкологические и инфекционные болезни. Аллергические реакции и другие побочные эффекты исключены, так как используются аутологичные клетки. Восстановительный период – отсутствует.
SPRS терапия – абсолютно безопасная технология, которая прошла множество клинических исследований. Комбинированное лечение кожи другими косметологическими процедурами в сочетании с SPRS позволяет достичь еще более выраженных результатов, в сравнении с воздействием от тех же процедур на неподготовленную кожу.
Эффект
Процесс старения кожи связан с катастрофическим снижением количества фибробластов. На биологическом уровне SPRS терапия позволяет восполнить дефицит фибробластов и создать все условия для стимуляции естественных процессов обновления кожи путем добавления собственных новых клеток.
После проведенной SPRS терапии вы ощущаете повышение плотности кожи, ее упругости, эластичности, подтягивается контур лица. Вы видите, как уменьшаются морщины, а цвет лица отличает здоровый румянец, появляется эффект «детской» кожи, мягкость и сияние. Коррекция причин, а не последствий старения – уникальное преимущество SPRS, которое позволяет получить впечатляющий результат.
Первые видимые изменения появляются спустя месяц после процедуры. Устойчивый эффект сохраняется до 24 месяцев и все это время «новые» аутологичные клетки обогащают кожу питательными активными веществами, разглаживая морщины, поддерживая нормальный уровень увлажненности кожи и сохраняя молодость. Поддерживающую процедуру можно повторить через год, однако, как правило, в зависимости от образа жизни пациента, такая необходимость возникает не ранее чем через 2-3 года.
Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования
С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»
И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»
Введение
Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.
Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).
В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.
Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).
Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.
Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.
Материалы и методы
Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.
Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.
Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).
Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).
Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.
Результаты и обсуждение
В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).
Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже
По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).
Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.
Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.
Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.
В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.
Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).
Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.
Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.
На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.
Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия
Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).
Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).
Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Заключение
Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.