Фермент люцифераза что такое
ОЧЕНЬ ВАЖНО. ПРАВДИВАЯ СЕНСАЦИЯ и Знамения Апокалипсиса! Что такое «фермент Люцифераза» и «ген Бога», и как они связаны с новыми разработанными вакцинами, в т. ч. той, которую навязывает всему мiру Билл Гейтс! Весьма настоятельно рекомендуем ознакомиться с этой информацией! (Видео)
Как сказал однажды св. прп. Паисий Святогорец: «Я бы сошел с ума от несправедливости этого мiра, если бы не знал, что последнее слово останется за Господом Богом»!
«Даже раввины начинают понимать, что Новый Мiровой Порядок, который выстраивают на земле закулисные кукловоды из «глубинного государства» («Deep state»), весьма далек от их представлений о «царстве мошиаха», прихода которого они ожидают!» — http://monomah.org/archives/25522.
В продолжение этого материала читайте и другую публикацию: «Безпрецедентное и уникальное совпадение мнений православных архиереев и иудейских раввинов — это, пожалуй, самая лучшая иллюстрация того, насколько серьёзно сегодня наше положение и как велики угрозы всему человеческому роду!» — http://monomah.org/archives/25912.
«Валентин Катасонов: Кто сможет выжить? Сегодня на глазах происходит ЛОМКА ЧЕЛОВЕКА, и кроме того, ведется борьба С ЧЕЛОВЕКОМ под видом борьбы с «ковидом»! — http://monomah.org/archives/25893.
«ПРАВДИВАЯ СЕНСАЦИЯ! Почему слуги дьявола столь усердно навязывают экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО)? В чем заключается огромная духовная опасность зачатия «детей в пробирке» — http://monomah.org/archives/8522.
Закулисные мiровые кукловоды явно спешат к какой-то дате, и, в этом смысле, отнюдь не случайным выглядит принятый в России 1 апреля 2019 года т. н. «закон о СНИЛС», согласно которому «россиянская власть» сбросила маски и, наконец, открыто объявила, что СНИЛС — это отнюдь не «страховой номер» некоего «индивидуального лицевого счета», а ЧИСЛОВОЕ ИМЯ каждого человека, принявшего его, — иначе говоря ЧИСЛО ЗВЕРЯ, о котором говорит Апокалипсис и которое должно присваиваться людям антихристом и его слугами вместо имен, данных им от Бога при рождении (см.: http://monomah.org/archives/15793, а также: http://monomah.org/archives/15966, а также: http://monomah.org/archives/16411).
«ОЧЕНЬ ВАЖНО. О звериной сущности биометрической идентификации! Еще в 1935 году гражданам США были присвоены идентификационные номера, которые содержались в выданных им картах социального страхования и они используются… до настоящего времени! Сегодня же с помощью лазера на полинуклеотидах, из которых состоит ДНК, формируется так называемый «ДНК-чип»!» — http://monomah.org/archives/16351.
При волновой перестройке ДНК через 8-10 месяцев само начертание, согласно одному из предсказаний, начнется светится на лбу или руке, и люди поначалу будут стесняться этого, но потом — начнут даже бравировать этим «свечением»! Позже (или одновременно) начнет «перестраивается» и душа, отторгая и исторгая из себя то, что делало ее ОБРАЗОМ И ПОДОБИЕМ Божиим! Именно таким образом человек уже при жизни и трансформируется в БЕСА! На эту тему рекомендуем почитать наши материалы: http://monomah.org/archives/13522, а также: http://monomah.org/archives/3175 и http://monomah.org/archives/3499 — ред.)
А также ознакомьтесь с подборкой о сбывшихся пророчествах: «Знамения Апокалипсиса: Сбылось еще одно важное иудейское пророчество, связанное с приходом… мошиаха!»
Дорогие братья и сестры! Мы не ставим своей целью пугать вас подобными публикациями, тем более, ввергать в панику! Подобные материалы печатаются не для устрашения, а для ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ всех верных: ведь предупрежден — значит, вооружен! Так получилось, что Господь, и это уже данность, привел нас жить в последние времена этого обветшавшего мiра, а ведь некоторые святые даже мечтали об этом — потому что венец устоявших при этом в Боге будет просто велик: согласно известному пророчеству старца Исхариона, ПОСЛЕДНИЕ будут выше ПЕРВЫХ (несмотря на то, что не совершат никаких особых подвигов и тяжких трудов — спасутся только ТЕРПЕНИЕМ и СМИРЕНИЕМ, и тем что устояли от поклонения антихристу)! Поэтому — НИКАКОГО ОТЧАЯНИЯ и УНЫНИЯ! И всегда надо помнить другое пророчество многих святых: БОГ ВСЕХ СВОИХ КАКИМ-ТО ЧУДЕСНЫМ ОБРАЗОМ, НО ОБЯЗАТЕЛЬНО ИЗБАВИТ ОТ БЕДСТВИЙ И СПАСЕТ! Мученическую кончину Господь дарует только тем, кто этого ОСОБО ДОСТОИН и кто СПОСОБЕН принять ее (хотя известно, что при этом Бог попустит этим мученикам и исповедником лишь такую меру боли, какую они способны вынести — остальную возьмет НА СЕБЯ: читайте на эту тему очень важный материал о промыслительном чуде, которого сподобились Семь Ефесских отроков, и мужественной кончине, которую Господь послал Семи мученикам Маккавейским, — http://monomah.org/archives/18597. С каждым Бог управит, сообразуясь с его силами)! Так что мужайтесь, и ни в коем случае не впадайте в уныние! Слава Богу! Аминь!
Люцифераза, или как распознавать привитых
Среди антипрививочников разошлась информация, что в вакцину добавляют некое «светящееся вещество», которое можно определить прибором типа бесконтактного градусника, которым меряют температуру пассажирам в аэропортах. В связи с чем теперь легко можно выявить тех, кто не привит.
Слухи оказались правдой, впрочем, с этого были сделаны весьма оригинальные выводы.
Как пишет издание iz.ru, ученые из Университета Куинс и Университета Британской Колумбии (Канада) разработали биосенсор для новых мутаций SARS-CoV-2.
Прибор оценивает взаимодействие шипа коронавируса и фермента АСЕ2, через который он проникает в организм. К шипу ученые прикрепили один фрагмент белка люциферазы, а к ферменту — другой. При соединении двух компонентов люцифераза светится (этот же фермент работает у светлячков). По интенсивности света можно оценить, как много шипов связалось с АСЕ2. Анализ занимает полчаса, сообщили ученые.
Прибор можно применять, например, для оценки эффективности лекарств против SARS-CoV-2. Если препарат для блокировки шипа вируса работает, то система не будет выделять свет, поскольку фрагменты люциферазы не соединятся. Кроме того можно косвенно оценить заразность нового штамма коронавируса, если мутация затронула именно шип.
«Этот простой и быстрый биосенсор значительно ускорит обнаружение вирусных мутантов и процессы открытия лекарств против COVID-19», — подытожили авторы изобретения.
Люцифер формирует собственное «стадо»
Информация была размещена в январе 2021 года. И сразу за ней посыпались «доказательства» антипрививочников, что их вычислили, благодаря прибору.
Например в Волосе у врача, который якобы «сделал прививку» 20 пациентам, а на самом деле просто выдал сертификат (с занесением в систему), пациентов вычислили, и теперь ему грозит уголовная ответственность. В принципе есть 2 варианта: либо врача кто-то «сдал», либо. в вакцине и правда есть «люцифераза».
Странный компонент вакцины неизвестно зачем добавлен туда (он безвреден для здоровья, но и от ковида не спасает). Тогда зачем он вообще нужен в составе вакцины?
Об этом сообщила блогер из Италии, которая тщательно изучила информацию о составляющих вакцины, изложенную на государственном сайте. И обнаружила данный химический элемент в ее составе.
Конечно, голословно говорить, без фактов, это подвергать себя критике, но дама подробно выложила в видео свои соображения на этот счет, обосновав их.
Да и вообще. название люцифераза вам ни о чем не говорит? Впрочем, это не «народное» название, информация о веществе изложена в Википедии.
(Мнение редактора может не совпадать с мнением автора, изложенном в материале).
Самый страшный ген
Сначала были светлячки. Эти насекомые, как известно, умеют излучать свет и использовать его в своих целях. Их таинственные огоньки — следствие удивительной реакции окисления люциферина, катализируемой ферментом люциферазой, чрезвычайно эффективной реакции, превращающей энергию химических связей в световую с недостижимым для человека КПД.
Затем пришла наука. Ученые разобрались, какие молекулы и во что они превращаются, какие гены кодируют нужный для превращения фермент. Нарушив естественный ход вещей, люди модифицировали растение, резуховидку Таля, научив ее светиться. Мутант часто бывает на орбите (http://science.nasa.gov/science-news/science-at-nasa/2013/06may_ arabidopsis), но практическое применение растение вряд ли найдет. Так и останется объектом для научных опытов.
Еще были биохакеры из Кембриджа (http://2010.igem.org/Team:Cambridge). Они работали с бактериями. Наделили их способностью превращать продукт окисления люциферина — оксилюциферин — в исходное вещество. Полученные ГМ-бактерии не нуждались в постоянной подпитке сырьем. Достаточно было обычной бактериальной еды, энергию которой они тратили на регенерацию люциферина. Свет при этом они давали достаточный для того, чтобы можно было читать при свете небольшого ферментера с бактериями. Но это еще не всё. Путем точечных мутаций в гене удалось получить разноцветное свечение. Не цветомузыка, но уже подойдет для украшения елки.
Оставалась маленькая проблема. Люциферин, даже с регенерацией, не вечен. А бактерии — не самые практичные организмы для использования в быту. Нужно именно растение, которое могло бы светиться независимо от внешних источников люциферина. Самодостаточное, регулирующее начало и конец свечения, в зависимости от времени суток. Теоретически, это можно сделать. Всего лишь воспроизвести в клетке синтез не только люциферазы, но и самого люциферина и привязать эти процессы к циркадным ритмам.
«Это можно сделать», — подумали вдохновленные успехами биохакеров авантюристы из команды проекта «GlowingPlant» (http://glowingplant.co)
Казалось бы, плюнуть на этих «зеленых», мало ли в мире чудных людей? Успех бизнес-модели налицо, кого интересует мнение алармистов? Надо побольше таких проектов. Но что-то вдруг пошло не так. 31 июля Кикстартер официально объявил о прекращении поддержки любых проектов, связанных с ГМО. Почему? Неужели подействовали параноидальные письма? Чем так напугали растения с люциферином?
Нет, дело явно не в письмах. Не может быть всё так просто. Бизнес, для которого важны только деньги, не запугать потенциальными последствиями для человечества. Бизнесмен удавится сам и удавит всех вокруг за 300% прибыли! Должны быть более серьезные основания!
И вдруг всё встало на свои места. Речь идет о спасениии всего рода людского.
Есть что-то зловещее в светящихся растениях, и это не случайно. Иногда содержание определяется названием. Вещества не всегда именуются по строгой номенклатуре. Иногда они получают говорящие имена. Люциферин и люцифераза, светящиеся во тьме, вряд ли случайно названы созвучно с именем врага человеческого. Как мы только посмели связаться с генами самого Люцифера и даже изменять их? Почему мы не задумались о последствиях? Хорошо, что ответственные люди обрели духовность и нашли в себе силу остановить вакханалию прогресса.
А если серьезно, то это грустно. Я уже начал мечтать о том, как на моей малой родине, где освещение разбитых дорог в XXI веке считается чем-то не модным и не нужным, посадят светящиеся ночью ГМ-елки и ГМ-березы. Видимо, будут светить гены Люцифера только там, куда их поместили изначально. В светлячках. А мы проживем как-нибудь без них и еще без множества новых, нужных и просто удобных открытий.
Главное ведь, чтобы апокалипсиса не было.
Справедливости ради отмечу, что шанс увидеть самодостаточную светящуюся резуховидку Таля у нас еще есть. Запрет не коснется текущих проектов.
Рис. О. Добровольского
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Люцифераза
Люцифера́за — общий термин для класса окислительных ферментов, катализирующих реакцию, сопровождающуюся испусканием света, биолюминесценцией. Наиболее широко известна люцифераза светлячков (КФ 1.13.12.7), в частности светлячка Photinus pyralis. [1] В биологии широко используется в качестве лабораторного реагента люцифераза как правило из этого вида. Название фермента, также как и его субстрата люциферина происходит от слова Люцифер („светоносец“).
Содержание
Реакция
В люминесцентных реакциях свет образуется при окислении люцеферина. Общий вид происходящей реакции:
Как правило продуктом реакции является CO2. Без люциферазы скорость реакции между люциферином и кислородом крайне низкая и катализируется люциферазой. В некоторых случаях реакция требует в качестве кофактора кальций или АТФ. [2]
Реакция, катализируемая люциферазой светлячков проходит в две стадии:
Свет возникает при переходе оксилюциферина из возбуждённого состояния в основное. При этом оксилюцеферин связан с молекулой фермента и в зависимости от гидрофобности микроокружения возбуждённого оксилюциферина испускаемый свет варьирует у различных видов светлячков от жёлто-зелёного (при более гидрофобном микроокружении) до красного (при менее гидрофобном). Дело в том, что при более полярном микроокружении часть энергии рассеивается. Люциферазы из различных светляков генерируют биолюминесценцию с максимумами от 548 до 620 нм. В целом энергетическая эффективность реакции очень высокая: практически вся энергия реакции трансформируется в свет без испускания тепла.
Применение
В реакции, катализируемой люциферазой, свет испускается только в том случае, если люцифераза взаимодействует со специфическим люцифериновым субстратом. Эмиссия протона может быть детектирована специальной светочувствительной аппаратурой, например, фотометром или модифицированным оптическим микроскопом.
В биологических исследованиях, гены, кодирующие люциферазу используются, в основном, в качестве репортёрных. Они позволяют оценить транскрипционную активность в клетках, трансфектированных с помощью генетических конструкций, включающих в себя ген люциферазы, который находится под контролем промотора исследуемого гена. Также люцифераза может использоваться для оценки уровня АТФ в клетках, что позволяет проверять жизнеспособность клетки или активность ее киназ. Дополнительно пролюменисцентные молекулы, которые превращаются в люциферин под действием специфических ферментов, могут использоваться для оценки ферментативной активности в сцепленном или двухступенчатом анализе. В частности, такие субстраты используются для анализа активности каспаз и цитохрома P450.
Огоньки под ногами
Сразу две статьи этого номера «Химии и жизни» рассказывают о свечении биообъектов. На фото слева — малощетинковый червь Fridericia heliota, открытый учеными из Красноярского университета. О том, как был исследован его люциферин — вещество, которое при окислении ферментом люциферазой испускает голубоватый свет, — читайте в статье «Огоньки под ногами». На фото справа — синтетический люциферин фридериции в присутствии АТФ и других необходимых компонентов демонстрирует такое же свечение, как и белковый экстракт червя. Это подтверждает, что структура люциферина установлена верно.
В статье «Флуоресцентные репортеры и их репортажи» рассказывается о возможностях, которые предоставляет ученым флуоресценция, свечение вещества, индуцированное светом с меньшей длиной волны. Биомолекулы, несущие флуоресцентные метки-репортеры, — это не только информативно, но и красиво. Лучшее тому подтверждение — микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World: а — фибробласты мыши, б — веслоногий рачок Temora longicornis; в — митоз в клетках легких тритона; г — клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).
Пример «неживой» флуоресценции — коллоидные растворы квантовых точек разного размера. Квантовые точки — полупроводниковые кристаллы нанометровых размеров. Электроны в них могут совершать квантованные энергетические переходы, причем энергия переходов (а значит, и длина волны флуоресценции, или ее цвет) зависит от размера кристалла.
Напомним основные термины. Люминесценция — все виды излучения, вызванные возбуждением молекул. В частности, флуоресценция — свечение, возникающее после того, как вещество поглощает другое излучение. Всем известный пример флуоресценции в биосистемах — зеленый флуоресцентный белок GFP, найденный у медузы Aequorea victoria и ставший родоначальником семейства флуоресцентных белков, которые широко применяются в фундаментальной и прикладной науке. За открытие и разработку методов использования этих белков получили Нобелевскую премию по химии 2008 года Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен.
Хемилюминесценция возникает в химических реакциях; применительно к биообъектам именно ее часто называют биолюминесценцией, опуская «хеми». Живые организмы никогда не оставляют химические реакции на произвол случая — практически каждая катализируется специально для этого приспособленным ферментом. Биолюминесценция не исключение: фермент люцифераза окисляет низкомолекулярное вещество люциферин, тот превращается в оксилюциферин, в итоге выделяется энергия — квант света. Биолюминесценция много раз возникала на разных ветвях эволюционного древа, поэтому люциферины — это группа разнообразных веществ с общей функцией; у разных животных — различные люциферины и, конечно, разные люциферазы. Классический пример люциферин-люциферазной реакции — огонек светлячка. У некоторых организмов осуществляется другой вариант: люциферин присоединяется к так называемому фотобелку и уже на нем окисляется при добавлении ионов металла (чаще всего кальция). Более сложный случай — перенос энергии с белка на белок с изменением спектра излучения. Так, свечение зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria возбуждается синим светом другого белка — экворина. Он стал первым изучаемым фотобелком; его открытие в 1961 году было заслугой Осаму Шимомуры. Люциферин экворина называется «целентеразин», причем экворея не синтезирует его сама, а получает с пищей, поедая мелких членистоногих. Еще известна биолюминесценция грибов — светятся даже всем известные опята и валуи! — но она протекает по иному механизму и пока мало изучена.
Два года назад мы писали о мегагранте, который получили красноярский Институт фундаментальной биологии и биотехнологии (ИФБиБТ) Сибирского федерального университета и Осаму Шимомура (см. «Химию и жизнь», 2012, №7). Среди основных задач проекта были изучение молекулярно-клеточной организации биолюминесцентных систем высших грибов, кольчатых почвенных червей и других групп организмов, а также создание аналитических систем, использующих явление биолюминесценции, для медицины и мониторинга окружающей среды. В проекте участвовали сотрудники красноярских Института биофизики СО РАН и Института физики им. Л. В. Киренского СО РАН, московского Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (подробности см. на сайте Биолюминесцентные биотехнологии).
Именно возможность изучать фундаментальные проблемы биолюминесценции заинтересовала Осаму Шимомура (нобелевского лауреата, уже весьма немолодого, журналисты постоянно спрашивали, как он решился на совместный проект, который требовал его длительного присутствия в России). «В 60-е годы эта область науки развивалась очень интенсивно, в 70-е — умеренно, а к настоящему времени практически сошла к нулю, — говорил он на пресс-конференции во время первого визита в Красноярск. — Очень тяжело получать результаты, это упорный труд, который занимает много времени. В Японии и Соединенных Штатах те, кто встречается с такими трудностями, как правило, находят более легкие пути. Я несколько раз предлагал проводить исследования грибов в Японии, и мне отказывали. Это очень интересная тема, но слишком сложная». Между тем без фундаментальных работ не будет и новых практических применений.
Светящихся животных в природе много. Из десятков видов «сухопутных» обладателей биолюминесцентной люциферин-люциферазной системы самые знаменитые — светляки, но гораздо больше светящихся организмов в морях и океанах. Это бактерии, губки, одноклеточные водоросли динофлагелляты, кишечнополостные — кораллы и медузы, моллюски, иглокожие, морские ракообразные (например, рачки рода ципридина, которых японцы называют «умихотару» — морской светляк; их светящиеся вещества выделил Осаму Шимомура еще до своего отъезда в США), многощетинковые черви. Помните, в «Человеке-амфибии» Александра Беляева: «Ихтиандр смотрит вверх — перед ним свод, сплошь усеянный мелкими, как пыль, звездами. Это ночесветки зажгли свои фонари и поднимаются на поверхность океана. Кое-где во тьме виднеются голубоватые и розоватые светящиеся туманности — плотные скопления мельчайших светящихся животных. Медленно проплывают шары, излучающие мягкий зеленоватый свет. Совсем недалеко от Ихтиандра светится медуза — она похожа на лампу, прикрытую затейливым абажуром с кружевами и длинной бахромой». Ночесветки — это как раз динофлагелляты Noctiluca scintillans, мельчайшие организмы, вызывающие свечение моря.
Люциферин-люциферазная система есть и у менее экзотических животных. Это земляные малощетинковые черви, представители того же класса, что и хорошо знакомый аквариумистам трубочник или дождевой червяк.
Один из участников мегагранта, Валентин Петушков, впервые увидел их еще студентом на биостанции Красноярского университета. Ночью в сырой земле рядом с палатками, в которых жили студенты, ярко светились какие-то точки. Источниками свечения оказались невзрачные беленькие червячки длиной один-два сантиметра. Гораздо позже, уже работая в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН, Валентин вспомнил этот случай. Поиск по научной литературе ничего не прояснил, обнаружились лишь некоторые сведения о свечении крупных тропических червей. В конце 80-х В. Н. Петушков и Н.С. Родионова поехали на биостанцию, собрали там образцы почвы и нашли в них тех самых загадочных светящихся червей. Красноярские специалисты по систематике не смогли назвать их вид: в определителях этого червя не оказалось. Первое краткое описание было сделано при участии московского специалиста по беспозвоночным Н. Т. Залесской. Новый вид отнесли к уже известному роду Fridericia и дали ему красивое название heliota (от греческого helios — Солнце и otos — ухо; на уши похожи выросты их семяприемников). В ответ на механические, химические и электрические раздражители Fridericia heliota излучает голубоватый свет; свечение длится примерно десять минут, постепенно затухая. Светящиеся точки расположены на поверхности тела червя, целомическая жидкость, заполняющая тело изнутри, не светится (рис. 1).
Рис. 1. Червь Fridericia heliota и его люциферин
К тому времени были известны двенадцать видов тропических червей (из шести родов), светящихся в результате однотипной люциферин-люциферазной реакции. Хорошо была изучена мегасколецида Diplocardia longa — крупный (до 60 см!) червь, обитающий в песчаных почвах юга Джорджии (США). Люциферин D. longa — алифатический альдегид N-изовалерил-З-амино-1-пропаналь. Если добавить его к целомической жидкости других светящихся червей, начнется люминесценция — это значит, что их люциферазы способны окислять люциферин диплокардии. Однако в случае сибирских фридериций такая реакция не идет, следовательно, их биолюминесцентная система имеет иную природу.
В 2000-е годы Петушков и Родионова занялись этой темой вплотную. Проблема, с которой всегда сталкиваются специалисты по биолюминесценции, — получение достаточного количества биомассы для выделения и исследования веществ, участвующих в реакции. Характерно в этом смысле описание сбора материала на биостанции Фрайди Харбор, которое дал Шимомура в своей нобелевской лекции: «Мы начинали собирать медуз в шесть утра, а в восемь часть нашей группы принималась отрезать кольца (краевые участки зонтика медузы, наиболее ярко светящиеся. — Е.К.). Всю вторую половину дня мы проводили, экстрагируя экворин из колец. Потом мы снова собирали медуз с семи до девяти вечера, на завтра. Наша лаборатория выглядела как фабрика по переработке медуз, и пахло в ней медузами». В общем, первый шаг на пути к Нобелевской премии нельзя было назвать легким.
Непросто начиналось и исследование люциферина Fridericia heliota. Несколько лет подряд Петушков и Родионова ночами собирали червей в лесах, отмечали места их обитания, днем срезали почвенный покров, в мешках возили в институт и помещали в культиваторы, чтобы была возможность работать с червями и зимой. (Размножаться в лабораторных условиях сиятельные фридериции так и не захотели.) Позже из нескольких тонн почвы вручную выбирали червей (как мы помним, крошечных, не чета полуметровым американским). Ученые выделили люциферин и люциферазу, определили, что для их активности необходимы кислород, АТФ и ионы магния. Разработали методы очистки компонентов, получили УФ-спектр люциферина, исследовали влияние на реакцию in vitro рН и температуры, солей и детергентов.
Рис. 2. CompX — фрагмент люциферина Fridericia heliota; справа его неприродный изомер
Конечно, спектры снимали и для самого люциферина, хотя возможности исследования были жестко ограничены малым количеством вещества. На этом этапе произошла страшная история, которую мне рассказал Максим Дубинный. Когда настало время растворить пять микрограммов люциферина и отнести на ЯМР для самого главного анализа, к нему подошел коллега с вопросом: «А это что?», схватил пустую на вид пробирку. и уронил. Стеклянная пробирка с результатом трех лет кропотливой работы упала на кафельный пол, подпрыгнула, но не разбилась. Вот так у ученых и появляются седые волосы.
Результаты ЯМР-спектроскопии показали, что в состав люциферина червя, помимо Z-изомера CompX, входят остатки лизина и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Кроме того, стала известна брутто-формула люциферина: C23H29N3O11. Если вычесть из нее брутто-формулы лизина, ГАМК и CompX (с учетом двух молекул Н2О, которые должны были освободиться при образовании связей между фрагментами) — C23H29N3O11 – (C6H14N2O2 + C4H9NO2 + C11H10O6 – 2H2O), — то получим С2О3 — остаток щавелевой кислоты. Из-за небольшого количества люциферина удалось получить только часть спектров, необходимых для установления его структурной формулы, поэтому щавелевая кислота осталась «невидимой». Но главное — не было понятно, в каком порядке эти четыре остатка связаны между собой.
Если названные фрагменты соединены пептидными связями (карбоксильная группа одного фрагмента связана с аминной группой другого), с учетом того факта, что у CompX и оксалата нет аминогрупп, а у лизина их две, — получается десять вариантов. Теоретически можно было бы получить искусственно все возможные комбинации, однако на это уйдет слишком много времени. К счастью, методы ЯМР-спектроскопии позволяют узнать, какие именно карбоксильные группы в молекуле свободны, а какие участвуют в образовании пептидной связи. Для этого Максим Дубинный снял всего десять ЯМР-спектров при разных значениях рН (дело в том, что переход СООН-группы в СОО – в нейтральной или щелочной среде влияет на соседние группы, и эти изменения можно наблюдать). Оказалось, что карбоксилы ГАМК и лизина свободны, тогда как оба карбоксила CompX участвуют в образовании связей. Таким образом, вариантов осталось всего четыре (рис. 3).
Четыре кандидата на роль люциферина были получены в ИБХ группой синтеза природных соединений под руководством Ильи Ямпольского. «Соединение 1 оказалось идентичным по всем спектральным характеристикам природному люциферину, и, что самое важное, оно вступило в реакцию биолюминесценции с люциферазой червя с испусканием света. «Момент истины» настал 14 октября 2013 года: в этот день были получены спектры ЯМР, идентичные спектрам природного люциферина, а спустя два часа зарегистрирован сигнал синтетического люциферина на люминометре в присутствии АТФ и белкового экстракта червя» (из пресс-релиза авторов работы на сайте ИБХ РАН). Уже не было никаких сомнений, что структура нового люциферина установлена. Этот результат был опубликован в Angewandte Chemie, одном из самых престижных химических журналов.
Теперь стоит задать вопрос: что дальше? Мегагрант завершен. В ходе исследования образовался уникальный коллектив ученых, способный решать задачи, на первый взгляд кажущиеся неразрешимыми. Осаму Шимомура так отозвался об успехе российских коллег: «Теперь, я уверен, в области химии биолюминесценции исследователи вашей группы имеют самые высокие в мире стандарты и возможности. Ваша группа будет лидировать в области биолюминесценции, и я надеюсь, что вы получите адекватную финансовую поддержку, чтобы внести свой вклад в мировую науку». Полученные результаты весьма впечатляют. Люциферин Fridericia heliota сравнительно несложного строения, более стойкий, чем люциферин светлячка, не токсичный, в отличие от бактериального люциферина. Все это сулит хорошие перспективы его практического использования. Но, к сожалению, авторам пока не удалось очистить до индивидуального состояния и получить искусственно второй важный компонент новой биолюминесцентной системы — люциферазу Fridericia heliota, без которой «включить» люциферин невозможно, нельзя и независимо подтвердить результаты в другой лаборатории, а также применить их на практике. А значит, научный поиск будет продолжаться.
Кому и зачем нужна люминесценция
После рассказа о научном результате всегда остается о чем поговорить с авторами открытия. Зачем живые организмы светятся, зачем ученые исследуют свечение, каковы дальнейшие перспективы. На вопросы «Химии и жизни» ответили соавторы статьи в “Angewandte Chemie”, посвященной люциферину F. heliota.
 |  |
| Кандидат биологических наук Н. С. Родионова, научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН | Кандидат физико-математических наук М. А. Дубинный, научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН |
 |  |
| Кандидат биологических наук В. Н. Петушков, старший научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН | Кандидат химических наук И. В. Ямпольский, руководитель группы синтеза природных соединений, научный сотрудник лаборатория биофотоники ИБХ РАН |
— После вручения нобелевской премии 2008 года за флуоресцентные белки много говорили об их преимуществах перед люциферин-люциферазной системой. Есть ли преимущества у люциферин-люциферазной системы перед флуоресцентными белками?
М.Д. В живых организмах очень много флуоресцирующих компонентов, поэтому найти целевую флуоресценцию сложнее, чем свечение люциферина. Если же мы не подсвечиваем образец ультрафиолетом, но регистрируем свечение, это точно то, что нужно, — обычно живые организмы не светятся. Это означает чувствительность во много раз большую, чем у обычной флуоресценции.
И.Я. Иначе говоря, при регистрации флуоресценции всегда есть соотношение сигнал/шум, а у люминесценции шума почти нет. Преимущество по чувствительности — это первое, а второе — именно люминесценцию используют при высокопроизводительном скрининге (high throughput assay), например при поиске потенциальных лекарственных препаратов среди веществ-кандидатов, когда огромные роботы проводят много тысяч реакций одновременно.
— То есть флуоресцентный белок удобнее внедрять в биологические системы, а люциферин-люциферазную систему использовать для тестов in vitro, тестов и для медицины и экологии?
И.Я. Одно из применений люминесценции — измерение концентрации АТФ.
— Потому что люцифераза нуждается в АТФ для проведения реакции?
И.Я. Люцифераза светляка — да. Она была единственной АТФ-зависимой из семи ранее известных, наша оказалось второй. Можно взять десять тысяч образцов, добавить к ним люциферин-люциферазу и проверить концентрацию АТФ сразу во всех. На самом деле спектры приложений люциферин-люциферазной системы и флуоресцентных белков пересекаются, но не совпадают.
— Осаму Шимомура часто рассказывает, как люминесценцию используют в качестве датчика кальция.
И.Я. Сначала надо было открыть систему, нуждающуюся в кальции. Из тех, которые хорошо изучены, это пока только экворин. Или похожие на него белки, как обелин.
— Значит, каждая новая люциферин-люциферазная система — это потенциально новые применения?
И.Я. В принципе да. Но зато в чем преимущество флуоресценции перед люминесценцией: она более наглядна, с ее помощью можно разглядывать микроскопические структуры вплоть до одной молекулы и с помощью этого достигать очень высокого разрешения в микроскопии. С люминесценцией такое невозможно, к сожалению.
— А чисто физические методы, такие как квантовые точки — конкуренты биологическим?
И.Я. С квантовыми точками проблема в том, чтобы селективно их доставить куда-либо. С флуоресцентным белком можно задействовать генно-инженерные и молекулярно-биологические подходы, чтобы локализовать его или в ядре, или в мембране. С квантовыми точками такой селективности до сих пор не достигнуто. Пытаются ее достичь, например привешивают к ним какие-то сигналы локализации — партнеры по связыванию, антитела. Но пока шум там огромный. В общем, у каждого метода своя область применения и свои ограничения.
— Детский вопрос: какие есть гипотезы по поводу того, зачем животные светятся?
И.Я. Пока мы этого не знаем. Месяц назад я был в Швеции на конгрессе, посвященном люминесценции. Там кроме химиков были и биологи, которые пытаются ответить на этот вопрос. Я узнал для себя много нового, в частности что у биолюминесценции есть около 15 различных преимуществ.
— Аналог предупреждающей окраски, привлечение партнера.
И.Я. Да, и отпугивание хищника. Но то, что мне понравилось и чего я не знал до этого, — оказывается, медуза начинает светиться, когда ее атакует рыбка. Медузы небольшие, и рыбы их едят не очень крупные, но большие рыбы, видя этот сигнал, приплывают и съедают хищника, который пытался съесть медузу. Эдит Уиддер из «Ocean Research & Conservation Association» (США) с коллегами сняла фильм для канала «Дискавери». Им удалось впервые заснять на видео гигантского кальмара. Для этого они опустили в океан светильник, похожий на медузу, с огоньками по кругу, и пришли в полный восторг, когда на него кинулся кальмар — огромный, с двухэтажный дом. Он думал, что это медуза светилась в ответ на атаку рыбы, и даже, насколько можно приписывать кальмару человеческие реакции, казался очень недовольным, что никакой рыбы не было.
— А по поводу светящихся червей есть предположения, зачем им это нужно?
И.Я. В том числе и на этом конгрессе я спрашивал у биологов, но никто не смог мне этого сказать, даже специалисты.
— При том, что светящихся червей известно довольно много?
М.Д. В наших лесах их два вида. Второй — из рода Henlea, про них мы еще не знаем, как они светятся.
— Так есть еще и второй?!
В.П. Действительно, в тех же образцах почвы, которые мы в 89–90 годах собирали на биостанции, обнаружился и другой вид энхитреид (семейство малощетинковых червей, к которому принадлежат фридериции. — Примеч. ред.). Мы этого никак не ожидали, найти один-то светящийся вид было удачей, о двух даже мысли не было. Выбирали червей в темноте, промывали, рассматривали их внутренние органы под микроскопом, считали щетинки. Все сильно варьировало, но мы это списывали на наличие несветящихся червей, которые неизбежно попадаются в пробах. Мелких светящихся червей считали молодыми, тех, что покрупнее и потолще, — взрослыми. Чтобы все рассортировать, мы начали проверять червей в биолюминометре, помещая их по одному в кювету с водой, а потом смотрели под микроскопом. Но все еще больше запуталось. Наконец мы заметили, что после крупных червей светится сама вода в кювете, то есть что-то светящееся выделяется из них во внешнюю среду. А вот после тонких мелких светящихся червей вода не светится. В итоге у нас получились три группы: сорные несветящиеся, мелкие тонкие светящиеся и более крупные толстенькие светящиеся черви, которые вдобавок еще и выделяют светящуюся слизь. И по количеству щетинок, и по виду внутренних органов светящиеся черви оказались разными. Два вида! Это было потрясающе.
Н.Р. Позже мы сделали первые снимки. Валентин придумал оригинальный способ — червя просто прижимали пальцем через целлофан к фотопленке в темноте на определенное время, потом проявляли. На снимках тоже отчетливо было видно: тонкие черви, получившие позже имя Fridericia heliota, имели светящиеся точки на теле, а толстые, отнесенные нами к роду Henlea, выпускали светящееся облако слизи.
— У Henlea тоже люциферин-люциферазная система?
Н.Р. Да, но биолюминесцентные системы у них разные. Кроме люциферина, люциферазы и кислорода для биолюминесценции Henlea нужен кальций (в случае Fridericia heliota — АТФ и магний). Точный вид светящейся хенлеи еще не установлен. Есть три вида этого рода, наиболее близких к нашей по описанию, но ни с одним нет полного совпадения. Биолюминесценция не отмечена ни у одного из них, ведь «нормальные» ученые делали их описание при свете дня.
В.П. В лесах Красноярского края хенлеи попадаются редко: в удачных местах примерно одна к ста фридерициям. Но в одной старой статье, 1929 года, мы встретили описание очень похожего червя — Henlea irkutensis, правда про свечение не было ни слова. Съездили в Иркутскую область и там действительно нашли наших хенлей, на которых потом сделали ряд экспериментов, сравнили две биолюминесцентные системы и опубликовали результаты в «Докладах Академии наук». Основная же работа велась по теме Fridericia heliota.
— Так вот, возвращаясь к биологической целесообразности.
М.Д. По поводу целесообразности: любая люминесцентная система сначала возникает, а потом находит применение.
И.Я. Это, как известно, одна из трудностей эволюционной теории, которые отмечал еще сам Дарвин, причем именно биолюминесценцию он и привел в качестве примера. Этот признак, казалось бы, не может появиться постепенно: свечение или есть, или его нет. Но если признак не проявлялся фенотипически, то как он мог сформироваться под воздействием отбора?
— Обычно на это отвечают, что на ранних стадиях формирования он был нужен для чего-то другого.
И.Я. Но в данном случае совсем не очевидно, для чего. Есть версии, например защита от активных форм кислорода, но для меня не слишком убедительные.
М.Д. Мне кажется, раньше для чего-то мог быть нужен продукт окисления. То, что червяки светятся на любое воздействие, при любой активности, подтверждает эту гипотезу: активируется метаболизм, включается свет. Но точного ответа мы не знаем.
— Максим, расскажите, как вы стали участником этой работы Кто обращается к вам в лабораторию ЯМР-спектроскопии с просьбой определить структуру?
М.Д. Основная работа нашей лаборатории — установление структуры белков, причем обычно мембранных — это самая сложная структурная работа. Мембранные белки нельзя просто растворить в воде, они плохо кристаллизуются, поэтому рентгеноструктурный анализ мало помогает. К белку приходится добавлять модель мембраны, размер комплекса становится больше, это для ЯМР хуже. Такие комплексы менее стабильны, все время норовят выпасть из раствора в осадок. Рекомбинантные белки получить тоже трудно, потому что они не растворяются в самой клетке. Но, несмотря на методические сложности, мы эту тему двигаем. А иногда нас просят определить структуру какого-нибудь маленького соединения.
Первый наш вопрос: а почему этим стоит заниматься, чем это полезно? Очень хорошо, когда приходят люди, которые нашли какое-то активное соединение — уже выделили его, очистили, показали его активность. Они не могут гарантировать, что это соединение еще не известно науке, потому что это мы должны сказать, известно оно или нет. Но они говорят: у нас вещество, которое светится, или блокирует болевые рецепторы, или делает еще что-то интересное. Понятно, что на это стоит потратить время.
— Будут ли новые исследования люминесцентных веществ?
В.П. Конечно. Теперь, когда у нас есть огромный опыт с Fridericia heliota и отличная команда, думаем, нам удастся разобраться и с биолюминесценцией хенлеи.
И.Я. Не будем забегать вперед, но мы уже сейчас занимаемся другими люминесцентными системами. В частности, есть люминесцентная система грибов, к которой люди уже сто лет пытаются подступиться. У нас уже имеются первые структурные данные, которые мы сейчас готовим к публикации.
— Даже не спрашиваю, зачем грибам нужна люминесценция.
— Как сейчас, после завершения мегагранта, обстоят дела с финансированием?
И.Я. На то, чтобы просто работать, есть деньги. Но денег много не бывает, мы боремся постоянно.
— Вы не пробовали подавать на грант российского научного фонда?
И.Я. Я подавал именно на эту тему и получил отказ. Отзыв одного эксперта был положительный, а другой рассудил достаточно оригинально: у авторов отличные публикации, значит там уже все сделано, зачем им еще давать денег?
В.П. Мы сейчас попытаемся получить грант РФФИ. Посмотрим, удастся ли.
Беседовала Е. Клещенко
Литература:
Valentin N. Petushkov, Maxim A. Dubinnyi, Aleksandra S. Tsarkova, Natalja S. Rodionova, Mikhail S. Baranov, Vadim S. Kublitski, Osamu Shimomura, and Ilia V. Yampolsky. A Novel Type of Luciferin from the Siberian Luminous Earthworm Fridericia heliota: Structure Elucidation by Spectral Studies and Total Synthesis. Angewandte Chemie International Edilion, 2014, 53, 22, 5566–5568, doi:10.1002/ange.201400529.