Фильтраты фаголизатов бактерий что это

Что такое лизаты?

Лизаты запускают иммунные реакции для обеспечения защиты от реальных патогенов.

Любая бактериальная клетка имеет определенную структуру, заключенную в клеточную оболочку. Химическое или механическое разрушение клеточной оболочки вызывает гибель микроорганизма. Сам процесс разрушения клеточной оболочки называется лизисом. Лизаты – это продукт лизиса бактериальных клеток.

Применение бактериальных лизатов для профилактики острых респираторных заболеваний по механизму действия схоже с действием вакцин. Попадая в организм человека, они воспринимаются как чужеродные агенты и провоцируют выработку как специфических, так и неспецифических факторов защиты. Препараты на основе бактериальных лизатов могут быть местными и системными. Местные лизаты применяют в ротовой полости и верхних дыхательных путях. Целью местного применения лизатов является активация иммунного ответа непосредственно в очаге инфекции.

Бактериальные лизаты для местного применения подходят для лечения детей. Важно, что эти препараты восстанавливают баланс слизистой и ее микрофлоры, практически не вызывают побочных реакций, хорошо сочетаются с другими лекарствами: жаропонижающими, сосудосуживающими, антибиотиками и не вмешиваются в работу общей иммунной системы. При лечении неосложненных бактериальных инфекций лизаты помогают избежать или сократить применения антибиотиков. Местные препараты на основе лизатов бактерий применяются на любой стадии болезни 3 :

Лизаты не могут вызывать воспалительную реакцию, т.к. не являются живыми микроорганизмами, однако распознаются вполне однозначно рецепторами иммунных клеток как угроза развития заболевания, после чего и активируются защитные реакции.

Больше о лизатах бактерий можно узнать из нашего мультика «Лизаты бактерий».

Источник

Лизаты: тренажер для иммунитета

Обзор свойств и показаний разных бактериальных лизатов — грамотная консультация, исходя из запроса покупателя

Они появились в наших аптеках всего два десятилетия назад, но быстро заняли свою нишу и приобрели известность у врачей и пациентов. Безрецептурные представители этой группы могут стать прекрасным инструментом, расширяющим возможности фармконсультации и позволяющим эффективно помочь клиенту аптеки. Сегодня, когда эпидемиологический сезон в разгаре, самое время освежить знания о безрецептурных бактериальных лизатах, их сво йствах и показаниях.

Что это такое

Лизатом (от греческого «лизис» — «разложение») называют суспензию, которая образуется вследствие разрушения бактериальных клеток. Она включает частицы бактериофагов и обломки стенок микроорганизмов, которые не обладают патогенностью и, соответственно, не представляют инфекционного риска для организма.

У «обломков» сохраняется специфическая структура и рецепторы, которые распознаются иммунной системой как враждебные. При этом организм концентрирует защитные силы, чтобы противостоять «натиску». В результате формируется селективный иммунный ответ против штаммов бактерий, которые использовались при производстве лизата.

Все лизаты бактерий поливалентны, то есть содержат несколько штаммов микроорганизмов. Как правило, это патогены, которые чаще всего вызывают инфекции.

Каждый штамм бактерий культивируется in vitro, инактивируется и лизируется либо химически, либо механически, а затем проходит лиофилизацию — «холодную сушку». После этого полученные лизаты смешивают в определенных пропорциях [1].

Всё не так однозначно

В 2017 году итальянские ученые проанализировали 170 посвященных лизатам статей в Pubmed — крупнейшей англоязычной текстовой базе медицинских и биологических публикаций. Они сделали вывод, что многие свойства и особенности действия препаратов этой группы еще недостаточно изучены, а качество самих исследований не является удовлетворительным. По мнению авторов анализа, чтобы более полно изучить возможности лизатов, необходимо проводить дальнейшие исследования хорошего качества [2].

Таким образом, эффективность бактериальных лизатов нельзя назвать очевидной с точки зрения доказательной медицины.

Тем не менее, их назначают для стимуляции иммунного ответа при различных заболеваниях, в том числе в урологии (при хроническом цистите), гинекологии (для восстановления микрофлоры) и пульмонологии (для профилактики обострений ХОБЛ). Но наибольшую популярность бактериальные лизаты приобрели как препараты для лечения и профилактики инфекций дыхтельных путей.

Основная гипотеза, объясняющая механизм действия лизатов, предполагает усиление иммунного ответа за счет стимуляции клеточного и гуморального звена. Считается, что влияние лизатов на организм физиологичное, поскольку они естественным образом стимулируют собственные реакции на антиген и проявляют комплексный иммунотропный эффект [4]:

Местные лизаты при попадании на слизистую оболочку верхних дыхательных путей образуют тонкий защитный слой. В основе их действия лежит усиление синтеза IgА и снижение выработки IgE, с которым сопряжена гиперчувствительность и аллергизация [5]. При этом местные препараты, так же как и системные, действуют на факторы специфического и неспецифического иммунитета.

Рекомендуем топические лизаты

Топические бактериальные лизаты относятся к ОТС-группе. Их ассортимент включает всего 2 лекарственных препарата, существенно отличающихся и по составу, и по показаниям.

Комплексный препарат бактериальных лизатов «ИРС 19»

Смесь лизатов, входящая в состав «ИРС 19», применяется в форме интраназального спрея в 35 странах мира [5]. Препарат содержит комбинацию лизатов наиболее распространенных возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта, в том числе пневмонийных стрептококков, гемофильной палочки, золотистых стафилококков, моракселл, энтерококков и некоторых других.

Интересно, что состав препарата периодически обновляется и изменяется с учетом преобладания основных возбудителей заболеваний ЛОР-органов и дыхательных путей [5].

«ИРС 19» может использоваться при острых и хронических заболеваниях, а также как средство для профилактики инфекций и в период восстановления после уже перенесенного заболевания.

Лекарство используют интраназально, доза и курс зависят от цели (профилактика или лечение) и возраста больного.

На что обратить внимание клиента?

В начале лечения могут появиться чихание и усилиться выделения из носа. Обычно этот эффект носит кратковременный характер. Если реакция принимает тяжелое течение, рекомендуют уменьшить кратность введения препарата или вовсе отменить его [6].

«Имудон»

Препарат представляет собой смесь лизатов бактерий, которые чаще всего вызывают воспалительные процессы в полости рта и глотки, в том числе нескольких штаммов лактобактерий, золотистого стафилококка, кишечной палочки, клебсиеллы, а также грибов рода кандида.

«Имудон» используют для лечения взрослых и детей старше 3 лет. Доза и курс лечения зависят от показаний и возраста. Таблетки рассасывают во рту, не разжевывая.

На что обратить внимание клиента?

В течение часа после приема препарата не следует принимать пищу и пить воду [7].

Системные лизаты: работа изнутри

Системные бактериальные лизаты, по мнению некоторых специалистов, более активны, чем локальные, поскольку обеспечивают более длительный и прочный контакт со слизистыми оболочками (не смываются слюной) [8]. Единственным ОТС-представителем этой группы на сегодня является препарат «Исмиген».

«Исмиген»

«Исмиген» представляет собой бактериальный лизат, полученный механическим способом и обладающий высокой иммуногенностью [9]. Средство содержит 14 штаммов 8 видов инактивированных патогенных бактерий, наиболее распространенных возбудителей инфекций верхних и нижних дыхательных путей, в том числе золотистого стафилококка, пиогенного стрептококка, пневмонийного стрептококка, клебсиеллы, гемофильной палочки, моракселлы и других. Его кардинальное отличие от других системных лизатов — сублингвальный (подъязычный) путь введения.

Препарат достаточно изучен: данные 15 рандомизированных исследований с участием более 2500 пациентов подтверждают, что прием «Исмигена» позволяет сократить число респираторных инфекций по сравнению с плацебо у детей и взрослых [9].

Препарат применяют для лечения и профилактики инфекций у взрослых и детей старше 3 лет. Дозировка при лечении и профилактике одинакова — 1 таблетка в сутки. Курс лечения длится не менее 10 дней, курс профилактики — три цикла по 10 дней с 20‑дневными интервалами [10].

На что обратить внимание клиента?

Подъязычные таблетки принимают натощак. Их держат под языком до полного растворения, не рассасывая и не разжевывая.

«Бронхо-мунал», «Бронхо-ваксом»

Под торговыми названиями «Бронхо-мунал» и «Бронхо-ваксом» выпускается рецептурный системный химический бактериальный лизат ОМ-85. Он содержит лизаты 21 штамма 8 бактерий, которые наиболее часто вызывают острые респираторные бактериальные инфекции. Среди них — лизаты пневмонийного и пиогенного стрептококка, клебсиеллы, золотистого стафилококка и другие. Некоторые специалисты полагают, что химический лизат менее предпочтителен, чем механический, поскольку химический лизис происходит с применением щелочи. Это может приводить к денатурации белков и, как следствие, антигенов, что, в свою очередь, может привести к снижению иммуногенности [1].

Эффективность и переносимость ОМ-85 изучалась более чем в 300 научных работах, 40 из которых были рандомизированными контролируемыми исследованиями [11]. Их итоги подтвердили, что лечение ОМ-85 помогает предупреждать развитие различных инфекций дыхательных путей у взрослых и детей старше 6 месяцев.

ОМ-85 применяют во взрослой и детской практике по 1 капсуле в сутки и для лечения, и для профилактики инфекционных заболеваний. Доза для детей 6 мес. — 12 лет — 3,5 мг в сутки, для взрослых и детей старше 12 лет — 7 мг в сутки. Длительность лечения — не менее 10 дней, профилактики — 3 курса по 10 дней каждый с промежутком 20 дней между ними [12].

На что обратить внимание клиента?

Препарат следует принимать утром, натощак. Детям, которым сложно проглотить капсулу, можно смешивать ее содержимое с чаем, молоком, соком.

Нашли ошибку? Выделите текст и нажмите Ctrl+Enter.

Источник

Бактериофаги: современные аспекты применения

Бактериофаги: современные аспекты применения

Для современной медицины актуальнейшей проблемой является множественная устойчивость бактериальных возбудителей к антибиотикам и, как следствие, — вопрос: чем лечить больных? Резервы создания новых антибиотиков практически исчерпаны. Заболеваемость, вызванная полирезистентными бактериальными штаммами, в т.ч. госпитального происхождения, наносит колоссальный человеческий и экономический ущерб во всех регионах мира. Совершенно закономерно, что в такой ситуации мировая медицинская общественность вновь обратилась к бактериофагам — вирусам бактерий, их естественным врагам и регуляторам популяции. О них мы беседуем с Ольгой Сергеевной Дарбеевой, кандидатом медицинских наук, главным экспертом управления противобактериальных медицинских иммунобиологических препаратов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ.

— Ольга Сергеевна, что такое бактериофаги? В чем заключается принцип их действия и какими преимуществами обладают по сравнению с антибиотиками?

— Бактериофаги широко распространены в природе — в пресноводных водоемах, морях и океанах, их выделяют из почвы, сточных вод, из клинического материала от больных. Являясь одними из древнейших обитателей Земли, по численности они достигают 10 в 30 фаговых частиц. По характеру жизненного цикла фаги разделяют на вирулентные и умеренные. Истинно вирулентные фаги (строго литические) убивают бактерию-хозяина. Адсорбируясь на поверхности микробной клетки, проникают в ее цитоплазму, где интенсивно размножаются, используя структурные компоненты клетки, и разрушают ее. Далее зрелые фаговые частицы, готовые к новому заражению, разрывают клеточную оболочку, и литический процесс повторяется с новыми бактериальными клетками. Именно вирулентные бактериофаги обладают наибольшим терапевтическим потенциалом, поскольку только они способны уничтожать клетки бактерий-хозяев.

Умеренные фаги способны к интеграции в геном бактерии в виде профага, или размножаются, не вызывая гибели бактерий. В медицине их используют в диагностических целях для внутривидового типирования.

В качестве антимикробных препаратов бактериофаги гораздо старше антибиотиков. Они активно применялись до открытия антибиотиков, которые быстро вытеснили фаги с рынка. Этому способствовали нестабильные результаты лечения фагами, объясняющиеся низким уровнем диагностики, когда они назначались без бактериологического подтверждения диагноза, определения фагочувствительности возбудителя, а также недостаточный уровень знаний о биологии фагов, условиях производства, хранения и применения.

В нашей стране фаготерапия успешно применялась при лечении и профилактике кишечных и гнойно-септических женских инфекций, в том числе, грибковых инфекций, детских инфекций, а также раневых инфекций, фаговые препараты выпускали несколько предприятий, организованных при НИИ вакцин и сывороток.

Сегодня бактериофаги выпускают на предприятиях по производству медицинских иммунобиологических препаратов, где проводится контроль качества на всех этапах производства. В начале 2000-х гг. крупнейшие фаговые производства вошли в состав ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава РФ, в итоге остались самые сильные производства — филиалы в Нижнем Новгороде, Перми и Уфе.

Если антибиотики можно назвать тяжелой артиллерией, то бактериофаги — это снайперы, действующие направленно. Разрушая опасные микробы, они не подавляют собственную микрофлору, не обладают токсическим действием, не вызывают развития дисбактериоза или аллергических реакций, стимулируют различные механизмы иммунитета. На литическую активность фагов не влияет наличие резистентности бактерий к антибиотикам.

Если антибиотики вызывают массовую гибель бактерий, что может привести к токсическому шоку, то фаги действуют постепенно. Подчеркну, что бактериофаги не следует считать альтернативой антибиотикам. Они прекрасно сочетаются с антибиотиками при одновременном назначении в качестве дополнительной помощи. Как и в случае с антибиотиками, фаги назначают при наличии чувствительности возбудителя к фаговому препарату. Конечно, если состояние больного позволяет, вместо антибиотиков лучше использовать фаги, но если нужна быстрая помощь — необходимо назначение антибиотика.

Препараты бактериофагов — это стерильные очищенные фильтраты фаголизатов гомологичных видов бактерий, освобожденные от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо—и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальной клетки. Фаговые штаммы, входящие в состав препаратов, подобраны против наиболее часто встречающихся возбудителей бактериальных инфекций.

Специфическая направленность бактериофагов отражена в их названии: по составу они делятся на монопрепараты, содержащие вирулентные фаги бактерий одного рода или вида — стафилококковый, стрептококковый (в т.ч. энтерококковый), протейный, псевдомонас аэругиноза (синегнойный), клебсиелл пневмонии, коли, дизентерийный поливалентный, брюшнотифозный, сальмонеллезный гр. АВСДЕ), и комбинированные фаги, в составе которых монопрепараты. К комбинированным относятся: коли-протейный, клебсиелл поливалентный, пиобактериофаги поливалентные (очищенный, комплексный и Секстафаг®) — содержащие бактериофаги стафилококковый, стрептококковый, протейный, псевдомонас аэругиноза (синегнойный), клебсиелл, коли, а также Интести-бактериофаг, содержащий бактериофаги против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, протея, синегнойной палочки и энтеропатогенной кишечной палочки.

Лечебно-профилактические бактериофаги используют для перорального, наружного, местного, ректального применения, интраназального и конъюнктивального введения, введения в дренированные полости при лечении женских инфекций, в том числе, грибковых инфекций, детских инфекций, а также раневых инфекций.

— Ольга Сергеевна, как применяются бактериофаги в педиатрии?

— О бактериофагах как о наиболее щадящих антимикробных препаратах, не имеющих противопоказаний для назначения, лучше всего знали педиатры. В 1970—1990-е гг. ими активно лечили гнойно-воспалительные и кишечные инфекции новорожденных, детей раннего возраста. Бактериофаги, убирая патогенные бактерии, дают восстановиться нормальной микрофлоре. Сегодня в педиатрии, к сожалению, мало используют бактериофаги. Возможно, это недостатки преподавания в медицинских вузах или слабость отечественных производителей бактериофагов по сравнению с агрессивной политикой продвижения антибиотиков зарубежными фирмами. Однозначно это последствия трудных 1990-х годов, когда отечественная фармпромышленность не могла субсидировать пострегистрационные испытания и популяризацию своих препаратов. Очень хотелось бы, чтобы о бактериофагах больше рассказывали студентам-лечебникам медицинских вузов.

Заведуя лабораторией бактериофагов НИИ стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича более 20 лет, могу сказать, что мы инициировали и координировали клинические исследования по фаговой тематике в московском регионе. Наша лаборатория контролировала не только качество всех выпускаемых препаратов на соответствие нормативной документации, но и диапазон их действия в отношении возбудителей кишечных и гнойно-септических женских инфекций, в том числе, грибковых инфекций, детских инфекций, а также раневых инфекций из стационаров различного профиля.

Мы помогали производствам в сборе бактериальных штаммов современных возбудителей, в т.ч. для преодоления первичной фагоустойчивости, совместно с клиницистами участвовали в испытаниях новых препаратов. Консультировали клинических микробиологов и врачей, помогали госпитальным эпидемиологам крупных московских стационаров в организации использования бактериофагов для лечения и профилактики ВБИ.

Клиницисты ограничены стандартами лечения больных, а эпидемиологи, видя проблему глобально, могут предложить своему стационару или отделениям использовать фаготерапию и фагопрофилактику, в т.ч. с помощью целевых (для данного стационара) серий фаговых препаратов, адаптированных производителем к местным госпитальным штаммам. Особенность бактериофагов — возможность адаптации к циркулирующим среди населения бактериальным штаммам — возбудителям инфекций. Таким образом, преодолевая их первичную фагоустойчивость, можно создать промышленные серии препарата целевой направленности для этого региона.

Это качество фаговых препаратов неоценимо для решения проблемы госпитальных инфекций, поскольку ЛПУ несут большие потери от внутрибольничных инфекций, вызванных полирезистентными бактериальными возбудителями. По данным российских эпидемиологов, в стране ежегодно заболевают ВБИ около 2,5 млн пациентов и 320 тыс. медработников, а наносимый ими экономический ущерб достигает 5 млрд руб.

За этими цифрами стоят человеческие трагедии, когда развитие инфекций нивелирует результаты сложнейших хирургических операций или мероприятий по выхаживанию новорожденных. Отрадно отметить, что сегодня все чаще стали вспоминать о замечательных отечественных антимикробных препаратах. На состоявшихся в ноябре—декабре 2013 г. 3-м Международном конгрессе по профилактике госпитальных инфекций, 12-м Международном конгрессе детских инфекционистов и ежегодной конференции «Инфекции в онкологии» были представлены доклады по фаготерапии и фагопрофилактике.

Вместе с тем возросший интерес к бактериофагам спровоцировал негативную тенденцию в развитии фаговой проблематики — появление БАДов на их основе (в 2013 г. получено свидетельство о госрегистрации специализированного пищевого продукта) для применения работниками пищевых производств, а также в ЛПУ для профилактики госпитальных инфекций, о чем было сообщено на VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням. В прениях этого форума, а также 3-го конгресса по госпитальным инфекциям специалисты подвергли сомнению саму идею использования бактериофагов в качестве БАДов, поскольку бактериофаги являются препаратами выбора в антибактериальной терапии и применяются после определения фагочувствительности. Их назначают наиболее ослабленному контингенту — детям раннего возраста и хроническим больным, неподдающимся антибиотикотерапии.

Бесконтрольное применение бактериофагов в виде БАДов может привести к формированию фагоустойчивости возбудителей. Кроме того, после регистрации фаговых БАДов за их качество отвечает только производитель, в отличие от лечебных фагов как лекарственных средств, подлежащих сертификации (каждая выпущенная серия) в аккредитованных экспертных структурах.

В заключение нашей беседы хочу еще раз подчеркнуть биологическую перспективность бактериофагов в роли лечебных препаратов при условии их обоснованного применения.

Источник

Пожиратели бактерий: убийцы в роли спасителей

Пожиратели бактерий: убийцы в роли спасителей

«Враг моего врага — мой друг» — это утверждение как нельзя лучше выражает главную причину интереса человека к вирусам бактерий. Фото фагов: Claudius Schulze.

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Сегодня в связи с нарастающей проблемой антибиотикорезистентности ученые всего мира ведут поиски новых антибиотиков и способов борьбы с инфекционными заболеваниями. И всё больше ученые оглядываются на естественный, но почти забытый метод — фаготерапию. Бактериофаги — природные враги бактерий, существовавшие задолго до появления человека. Почему же мы не используем их вместо антибиотиков, которые привели к такой глобальной проблеме, как резистентность бактерий, ну или хотя бы в дополнение к ним? Что это за диковинные создания и могут ли они быть полезны человеку? Безопасны ли они? В этом обзоре мы попытались собрать воедино имеющиеся данные о бактериофагах и показать вам, насколько красив и многообразен их невидимый мир.

«Био/мол/текст»-2016

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2016.

Спонсор номинации — Future Biotech, проект, объединяющий профессионалов и энтузиастов в области биологии и биотехнологий.

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

ХХ столетие называют веком атома, нейлона и антибиотиков. С началом массового применения пенициллина в 1943 году медики всего мира получили мощнейший механизм для защиты организма от атак, казалось бы, всех болезнетворных бактерий. И ученые, подхватив знамя антибиотикотерапии, ринулись на поиски и разработку новых антибактериальных средств. Но если мирный атом и синтетические материалы с лихвой оправдали возложенные на них ожидания, то надежды на всемогущество антибиотиков, увы, постепенно тают: резистентность бактерий к ним становится всё шире. 16 сентября 2000 года на Всемирном дне резистентности в Торонто была принята Декларация по борьбе с бактериальной резистентностью [1], а годом позже ВОЗ опубликовала Глобальную стратегию по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам, в тексте которой есть такие строки: «Без согласованных действий всех стран многие великие открытия, сделанные учеными-медиками за последние 50 лет, могут утратить свое значение из-за распространения антибиотикорезистентности» [2]. Означает ли это, что мы в скором времени вновь окажемся бессильны перед бактериями? Существуют ли альтернативные подходы к борьбе с инфекционными заболеваниями? К счастью, да. Один из них — применение бактериофагов, самых многочисленных, древних и распространенных на нашей планете вирусов [3], существующих на Земле свыше 3 млрд лет и неоправданно заброшенных исследователями в 1960–1970-е годы на фоне успехов антибиотикотерапии.

Открытие

Несомненно, многие бактериологи наблюдали и описывали проявления действия фага на бактериальные культуры. В 1896 году английский бактериолог Э. Ханкин, исследуя антибактериальное действие воды индийских рек, пришел к выводу о существовании агента, проходящего через бактериальные фильтры и вызывающего лизис холерных вибрионов. По некоторым данным, российский микробиолог Н.Ф. Гамалея в 1897 году наблюдал лизис бацилл сибирской язвы. Однако первая научная публикация о фагах — статья 1915 года английского микробиолога Ф. Туорта, в которой он описал инфекционное поражение стафилококков, значительно изменявшее морфологию колоний. Инфекционный агент свободно проходил через бактериальные фильтры, и его можно было переносить из одной колонии в другую. Туорт выдвинул несколько гипотез, объясняющих это явление, в частности — гипотезу о фильтрующемся вирусе, подобном вирусам растений и животных. Однако его работа не привлекла внимания ученых, а Туорт забросил ее из-за службы в армии: началась Первая мировая.

В 1917 году канадский бактериолог Ф. Д’Эрелль независимо от Туорта сообщил об открытии вируса, «пожирающего» бактерий, — бактериофага [4]. Микробиологи того времени считали, что чума свиней вызывается совместным действием микроба и вируса. Д’Эрелль предположил, что схожая этиология и у дизентерии. С помощью свечей Шамберлана он отфильтровал фекалии больных дизентерией и добавил их в пробирки с культурами шигелл, намереваясь ввести смесь бактерий и предполагаемого вируса экспериментальным животным. Однако на следующие сутки он обнаружил, что бульон, в котором росли шигеллы, стал прозрачным, что свидетельствовало о гибели бактерий. Профильтровав бульон из этих пробирок, он снова заразил полученными фильтратами культуры шигелл. И вновь на следующие сутки он обнаружил, что бульон стал прозрачным. Полученное «литическое начало» можно было бесконечно пассировать от одной культуры к другой, что привело Д’Эрелля к мысли о существовании вируса, разрушающего бактерии. В дальнейшем он обнаружил фаги стафилококка, холерного вибриона и сальмонеллы. Учитывая эффективность фагов против патогенных микроорганизмов и их широкое распространение в природе, Д’Эрелль предположил, что они играют определенную роль в развитии иммунитета к инфекционным заболеваниям и выздоровлении.

В 1920–1940-е годы было проведено множество исследований по клиническому применению бактериофагов, однако стабильных результатов получено не было, и на Западе бактериофаги стали в основном объектом изучения биологов. В 1931 году Совет фармации и химии Американской медицинской ассоциации опубликовал обзор 150 работ по фаготерапии, в котором M. Итон и С. Бэйн-Джонс [5] утверждали, что природа фага неживая; возможно, это фермент, и ошибочно связывать воздействие фага на бактерии или его терапевтический эффект с его жизнедеятельностью. Такие выводы способствовали существенному сокращению капиталовложений в исследования по медицинскому применению фагов на Западе.

В СССР в ранние годы бактериофагам уделяли достаточно внимания. В 1923 грузинский микробиолог Г.Г. Элиава, ученик Д’Эрелля, основал в Тбилиси Институт бактериофагов, ставший впоследствии Всесоюзным центром фаготерапии, коллекция которого на сегодняшний день составляет около 3000 фаговых штаммов. Однако успешное применение антибиотиков в 1960–1970-е годы практически похоронило идеи фаготерапии. Так, например, в Большой советской энциклопедии указано: «Антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем их применение с лечебной целью сузилось».

Происхождение

Вопросом о природе бактериофага задавался еще Туорт в своей первой статье. Д’Эрелль в своем фундаментальном труде выдвинул несколько теорий (гипотез) происхождения фагов, из которых две сохранили значение до настоящего времени: «теория вируса» и «регрессивная теория».

В рамках вирусной теории бактериофаги, подобно вирусам растений и животных, рассматриваются как прямые потомки неких очень примитивных форм, существовавших еще до появления клеток, и представляют собой автономные агенты, являющиеся облигатными паразитами бактерий. Этой теории придерживался Д’Эрелль в самом начале своих исследований, и ее принимало как нечто само собой разумеющееся большинство вирусологов. Но эта концепция, по сути, мало что дает, так как в применении к вирусам такие термины, как автономность и паразитизм, трудно поддаются определению, а сама гипотеза сложно доказуема, поскольку нет ископаемых останков вирусов, а их родственные связи можно изучать только методами молекулярной филогенетики [6].

Согласно регрессивной теории, фаги постепенно развивались из более сложных форм жизни путем утраты всей протоплазмы, ненужной для присущего бактериофагу способа существования. Эта гипотеза лучше вписывается в современную биологию, так как промежуточные стадии процесса дегенерации довольно легко себе представить, а постепенную утрату бактериями способности к синтезу можно изучать экспериментально.

Вполне возможно, что бактериофаги произошли из примитивного полового аппарата бактерий, первоначально развившегося для передачи генетического материала от одной бактериальной клетки к другой. Это могло бы объяснить, почему некоторые фаги и в настоящее время способны выполнять эту функцию путем лизогенной конверсии. Теория предполагает, что генетический материал фагов — это редуцированный и модифицированный нуклеоид бактерий, сохранивший гомологию с «прародителем» и потому способный с ним рекомбинировать или даже частично замещать его. Это могло бы объяснить свойства умеренных фагов, способных встраиваться в определенные локусы ДНК клетки-хозяина, становясь частью бактериального наследственного аппарата. В процессе эволюции умеренные фаги могли путем дальнейших мутаций, влияющих на спектр литического действия [7], необратимо превращаться в вирулентные, поражающие хозяев, с которыми они не имели генетического родства. Согласно этой теории, различные штаммы фагов филогенетически не связаны друг с другом, и определенный фаг даже может быть филогенетически ближе клетке-хозяину, нежели другим фагам. Отсюда следует, что если данная теория верна, то между бактериофагами и вирусами животных и растений нет никакого родства, а фенотипическое сходство — чисто внешнее, обусловленное сходной экологией.

Тем не менее биоинформатические подходы — сравнения огромных массивов геномов и фолдингов белков, а особенно «архитектуры» фаговых частиц — всё же позволяют находить у бактериофагов, фагов архей и вирусов в целом филогенетически общие признаки [3], [8].

Строение и классификация

На протяжении почти 70 лет бактериофаги, как и другие вирусы, были для биологов такими же невидимыми, как атомы для физиков, в силу их субмикроскопических размеров. И только в 1942 году, с помощью недавно изобретенного (М. Кнолль, Э. Руска, 1931 г.) электронного микроскопа, будущий нобелевский лауреат С. Лурия (Колумбийский университет) и Т. Андерсон (RCA-лаборатория, Камден, Нью-Джерси) получили первые фотографии бактериофага Т2, или «анти-коли РС», как его называли Лурия и Андерсон (рис. 1).

Рисунок 1. Изображения бактериофага Т2, полученные С. Лурия и Т. Андерсоном с помощью просвечивающего электронного микроскопа: а — первая в мире фотография бактериофага (2 марта 1942 г.); б — бактериофаг Т2 в культуре Escherichia coli (2 марта 1942 г.); в — Т2 «крупным планом» (29 марта 1962 г.).

[42] (фото а и б)

Рисунок 2. Микрофотография фага Т2, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Фаги весьма разнообразны по морфологии — в отличие от вирусов животных и растений. Все известные в настоящее время вирусы эукариот имеют либо форму многогранника (икосаэдра), либо спиралевидный тип симметрии. Что же касается фагов, то среди них тоже встречаются формы со спиралевидным или кубическим типами симметрии, но подавляющее число изученных к настоящему времени фагов сочетает в одной частице оба типа: кубический — у головки, а спиралевидный — у отростка (рис. 2). Столь своеобразное строение фагов, отличающее их от других вирусов, объясняется наличием у бактерий ригидной клеточной стенки, которая исключает возможность проникновения вирионов в клетку путем пиноцитоза или виропексиса. Такая структурная особенность бактерий способствовала формированию у фагов других способов инфицирования, что и нашло отражение в их облике.

Именно морфология легла в основу современной классификации бактериофагов. Казалось бы, целесообразнее разделять фаги по принципу их связи с определенным видом микроорганизма, который они поражают, — что и легло в основу первых классификаций. Но этот принцип не обеспечивает необходимой точности, так как один штамм фага может поражать разные микроорганизмы, то есть иметь широкий литический спектр. И наоборот, один вид бактерий может поражаться несколькими фагами, различающимися между собой по целому ряду свойств, в том числе морфологически, тогда как фаги, активные в отношении разных видов и даже родов микроорганизмов, могут быть морфологически тождественны.

Были попытки классифицировать фаги и по сумме признаков (антигенных, физиологических, биохимических, физико-химических, морфологии негативных колоний, спектру литического действия и т. п.).

С развитием электронной микроскопии появилась возможность классифицировать фаги по морфологии. Дэвид Бредли в 1967 году предложил разделить фаги на шесть морфологических групп: с A по F (табл. 1, рис. 3). Вторая используемая классификация, предложенная А.С. Тихоненко в 1968, объединяет фаги групп D и E в одну (табл. 1, рис. 4). Микрофотографии фагов, относящихся к разным морфогруппам, представлены на рисунках 5 и 6.

Рисунок 3. Схематическое изображение фаговых морфогрупп по Бредли (1967).

рисунок автора статьи

Рисунок 4. Схематическое изображение фаговых морфогрупп по Тихоненко (1968)

Рисунок 5. Различные морфоварианты бактериофагов.

микрофотографии автора статьи

Рисунок 6. Микрофотографии бактериофагов из разных морфогрупп: а — фаг 1997 Yersinia enterocolitica с длинным несокращающимся чехлом; б — фаг Т3 с коротким отростком; в — фаг МS2 без отростка; г — фаг Х174 без отростка, с капсомерами; д — нитчатый фаг Fd.

микрофотографии автора статьи

Рисунок 7. Схема строения вириона фага семейства Myoviridae

Большинство фагов состоит из головки диаметром 45–140 нм и отростка («хвоста») толщиной 10–40 нм и длиной 100–200 нм (рис. 7). Так выглядят представители порядка Caudovirales («хвостатых фагов»), и именно их образ обычно извлекается из памяти при упоминании термина «бактериофаг». Содержимое головки состоит преимущественно из плотно упакованной молекулы ДНК или (реже) РНК, длина которой во много раз превышает размеры головки и достигает 60–70 мкм (рис. 8), и иногда небольшого количества белка — например, ферментов, которые осуществляют первичную транскрипцию генетического материала фага или способствуют ей. Капсид представляет собой белковую или (не у Caudovirales) липопротеиновую оболочку, собранную из множества копий одного или двух белков. Капсид может быть икосаэдрическим, сферическим, лимоновидным или плеоморфным [9], и именно он, по сути, определяет размер фагового генома.

Рисунок 8. Микрофотография бактериофага с высвободившейся нитью ДНК.

Отросток представляет собой белковую трубку, окруженную у ряда бактериофагов (семейства Myoviridae, типовой представитель которого — фаг Т4) чехлом, состоящим из сократительных белков, подобных мышечным, благодаря чему он способен сокращаться, обнажая часть стержня. С головкой отросток стыкуется с помощью белкового кольца — «портала» («воротничка»). На противоположном конце, в основании, отросток содержит лизоцим (как домен белка, пронзающего клеточную стенку), служащий для точечного растворения пептидогликана. Возможно и нахождение в основании отростка АТФазы, обеспечивающей энергией инъекции нуклеиновой кислоты в бактерию [10]. Там же у фагов такого типа имеется гексагональная базальная пластинка с несколькими шиповидными выростами и тонкими длинными нитями, с помощью которых фаг распознает рецепторы «своих» бактерий и прикрепляется к ним.

Нитевидные фаги имеют размеры 8×800 нм и лишены выраженных «органов».

Бактериофаги довольно устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они выдерживают колебания рН в пределах 5,0–8,0; большинство резистентно к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола. Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, УФ-облучении, действии некоторых химических дезинфектантов (в частности, кислот и формалина). Фаги хорошо сохраняются при низких температурах (до −200 °С в глицерине), но быстро инактивируются при 65–70 °С [10].

Взаимодействие с бактериями

Фаги — облигатные внутриклеточные паразиты, так как у них нет механизмов для выработки энергии и рибосом для синтеза белка. Размножение фага происходит только внутри бактерии-хозяина и посредством ее синтетической машинерии. Важным свойством бактериофагов является их специфичность: фаги могут поражать определенный вид бактерий (моновалентные фаги) или же только избранные штаммы/варианты внутри вида (типовые фаги, например, фаги V. cholerae classica и El Tor), но некоторые не столь разборчивы и поражают бактерий разных видов и даже родов (поливалентные фаги) [11]. Тем не менее очень сложно судить о специфичности фагов в природных условиях, поскольку там действуют многочисленные методологические ограничения и популяционные закономерности, и порой один и тот же фаг можно принять как за «генералиста», так и за «специалиста» [12].

По характеру действия на бактерии различают вирулентные и умеренные фаги.

Рисунок 9. Адсорбция фага PIcmlclr 100ts на поверхности Yersinia pestis.

микрофотографии автора статьи

Рисунок 10. Лизис E. coli и выход фаговых частиц. Справа — зрелая форма бактериофага.

микрофотографии автора статьи

Но некоторые фаги способны покидать клетку без лишнего шума. Так делает, например, фаг L2, паразитирующий в бактериях рода Acholeplasma, лишенных клеточной стенки (их знаменитые родственники — микоплазмы). Вначале он проходит все стадии, соответствующие определению «литический цикл» — но за исключением собственно лизиса хозяина: вирионы как бы отпочковываются от бактерии, захватывая небольшие участки ее мембраны, которые становятся оболочкой фага. После такого деликатного литического цикла L2 может приступить к лизогенизации [20].

Рисунок 11. Дефектные фаги — пиоцины (бактериоцины Pseudomonas aeruginosa). Многие бактерии (особенно γ-протеобактерии) экспонируют на своей поверхности тейлоцины (tailocins) — «перевернутых безголовых фагов». Эти фаговые хвосты незаменимы в конкурентной борьбе бактерий с близкими родственниками (такие структуры называют бактериоцинами), а иногда служат для поражения эукариотических клеток (PLTS, фагоподобные структуры для транслокации белков). Гены тейлоцинов бактерии заимствовали у различных профагов семейств Myoviridae и Podoviridae, причем ДНК одной бактерии может содержать несколько генетических кластеров разных тейлоцинов наряду с полноценными родственными либо неродственными профагами, кодирующими все «запчасти» вириона [43]. Размножаться «дефектные фаги» не могут из-за отсутствия головки с ДНК, однако множественные отростки на поверхности клетки-хозяина способны подобно шприцам с токсичным содержимым повреждать клетки жертв.

микрофотография автора статьи

Бактериальный иммунитет

Казалось бы: если бактериофаги атакуют любых бактерий и их численность настолько велика (фаги — самые многочисленные вирусные формы в биосфере Земли, их общее количество — 10 30 –10 32 фаговых частиц [21], что примерно равно количеству бактерий, 4–6×10 30 ), то почему они до сих пор не уничтожили всех бактерий? Ответ очевиден: в процессе эволюционного соразвития бактерии выработали своего рода иммунитет против фагов. Причем иммунитет многослойный. Во-первых, бактерия может быть изначально лишена рецепторов к тому или иному фагу или лишиться их посредством мутаций. Во-вторых, бактерия может быть иммунизирована уже «прописавшимися» в ней профагами, которые с помощью специфических репрессоров просто не дадут вновь прибывшим сородичам размножиться. В-третьих, бактерия (или ее мобильные генетические элементы) кодирует рестрикционно-модификационные системы, которые просто рубят на кусочки нуклеиновые кислоты, не содержащие особых метильных меток — подписей «я свой».

А в-четвертых. В 2005 году стало известно, что функциональной основой бактериального иммунитета является система CRISPR [22], двумя годами позже — что для ее работы критически важен белок Cas, а в 2012-м уже появилась возможность создания инженерных систем на основе CRISPR-Cas9 Streptococcus pyogenes [23]. Работа системы CRISPR-Cas основана на том, что небольшой фрагмент, вырезанный из проникшей в бактериальную клетку фаговой ДНК, вставляется в специальный участок (локус CRISPR) генома бактерии. Каждый локус CRISPR содержит множество таких вставок (спейсеров, разделенных особыми короткими нуклеотидными повторами), представляющих собой фрагменты ДНК встреченных когда-либо фагов и плазмид. На основе спейсеров синтезируются молекулы РНК, комплементарные соответствующему участку фагового (или плазмидного) генома. Эти РНК в комплексе с белками Cas затем опознают и обезвреживают мишень — чужеродную ДНК с комплементарной последовательностью нуклеотидов. Таким образом, если в клетку однажды проникла фаговая ДНК, но клетка выжила и встроила фрагмент чужеродного генома в свой нуклеоид, то последующие попытки таких же фагов эксплуатировать клетку или ее потомков будут неэффективны [24].

Впрочем, бактериофаги за счет случайных мутаций и отбора умеют обходить системы CRISPR-Cas. Чтобы конкретный спейсер потерял эффективность, достаточно даже незначительного изменения комплементарного ему фрагмента фагового генома. Поэтому фаги успешно и довольно быстро преодолевают приобретенный иммунитет бактерий за счет точечных мутаций. С другой стороны, системы CRISPR очень широко распространены у бактерий и, судя по всему, обеспечивают своим обладателям надежную защиту. Эффективность CRISPR обеспечивается тем, что даже две разные бактерии одного и того же штамма встраивают в свой геном разные спейсеры, соответствующие разным участкам генома фага. В результате популяция бактерий быстро приобретает генетическое разнообразие, что значительно повышает их шансы на выживание. Точечные мутации, «обезвреживающие» один спейсер, позволят фагам заразить только небольшую часть бактериальной популяции. К тому же, бактериофаг не может определить заранее, какие спейсеры имеются у конкретной клетки. Поэтому большинство фагов в полиморфной популяции бактерий погибает даже при высокой скорости появления точечных мутаций.

Такой феномен коллективного бактериального иммунитета был продемонстрирован на бактериях P. aeruginosa и фагах DMS3vir [28]. Для начала ученые убедились, что система CRISPR действительно защищает бактерий от данной разновидности фагов, а культуры бактерий с отключенной CRISPR-системой активно этим фагом поражаются, хотя и выработали иную форму защиты: у них распространились мутации, меняющие рецептор, к которому прикрепляется фаг. Такой способ защиты оказался менее эффективным, так как по истечении 30 суток эксперимента бактериофаги всё еще находились в популяции. Чтобы доказать, что разнообразие спейсеров системы CRISPR-Cas — основа эффективности коллективной иммунной защиты, ученые сравнили устойчивость к фагам у бактериальных популяций с разным уровнем разнообразия спейсеров. Оказалось, что фаги в монокультурах бактерий уже в первые сутки приобретали мутации, нейтрализующие соответствующие спейсеры. У фагов же в популяциях, составленных из нескольких клонов бактерий с различными спейсерами, устойчивость формировалась лишь в немногих случаях. В популяциях, сформированных из 24–48 клонов, фаги не смогли преодолеть защиту CRISPR-Cas.

Отсюда следует, что в монокультуре единичная мутация фаговой ДНК, обеспечивающая защиту от конкретного спейсера, позволяет фагу заразить любую бактерию, а в полиморфной культуре из 48 клонов точно такая же мутация обеспечивает успех с вероятностью лишь 1/48. Даже при условии, что ДНК фага встроится в бактерию, защиту которой он преодолел, его потомки снова столкнутся с той же проблемой, и она будет усугубляться по мере снижения численности бактерий, чувствительных к этому фагу.

Таким образом, точечные мутации и отбор — недостаточно эффективная для вирусов эволюционная стратегия, что объясняет успешность систем CRISPR-Cas и их широкое распространение у бактерий. Но тогда почему бактериофаги до сих пор не «вымерли» — раз эта система так эффективна? Не так давно у них обнаружили особые гены, подавляющие работу CRISPR [29]. А что же могут противопоставить бактерии? Ответ, опять же, в разнообразии: существует много разных вариантов системы CRISPR, каждый из которых уязвим только для некоторых анти-CRISPR-генов и защищен от других. Содержать же в своем геноме множество подобных генов бактериофаги не могут, так как отбор у них ведется преимущественно в направлении компактизации генома — в угоду увеличению скорости размножения.

Такая антагонистическая коэволюция фагов и бактерий, протекающая параллельно на разных уровнях и в разных временных масштабах (формирование новых спейсеров бактериями — точечные мутации фагов, выработка новых генов анти-CRISPR — формирование новых вариантов системы CRISPR) позволяет соблюдать баланс в системе «бактериофаг — бактерия» на уровне одной популяции и биоценоза в целом [28], [30].

Получение бактериофагов

Рисунок 12. Фаговые бляшки (зоны лизиса на культуре E. coli).

Бактериофаги широко распространены в природе. Везде, где есть бактерии — есть фаги. Их можно выделить из открытых полостей организма человека и животных, водоемов, сточных вод, почвы, из соответствующих культур бактерий и т.д. Большое количество бактериофагов находится в выделениях больных людей и животных, особенно в период выздоровления от инфекционных заболеваний.

Таким образом, поиск и выделение новых фагов не представляет трудности. Для выделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гной, почву и др.) засевают в жидкую питательную среду, инкубируют в термостате, и через сутки помутневшую жидкость пропускают через бумажный, а затем через бактериальный фильтры, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученный фильтрат исследуют на наличие бактериофага путем совместного посева с подходящей микробной культурой на плотные или в жидкие питательные среды. Если бактериофаг выделился, то после 18-часовой инкубации на поверхности агара вырастает сплошной газон культуры с прозрачными бляшками — зонами лизиса (рис. 12). В бульоне бактериофаг обусловливает просветление среды.

Для выделения чистой культуры бактериофага материал из отдельной бляшки переносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры.

Материал из вновь возникшего стерильного пятна засевают вместе с фагочувствительными микробами в жидкую питательную среду. После 6–18 часов инкубации среду фильтруют и получают чистую культуру бактериофага.

Для изготовления серийного препарата бактериофага применяют только апробированные штаммы и культуры микробов, обладающие типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими. Музейные производственные штаммы ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся фаговых штаммов через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам.

Промышленное получение бактериофага в настоящее время осуществляют в специальных аппаратах — реакторах емкостью 250–1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. В реактор наливают жидкую питательную среду, которую стерилизуют при температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среду охлаждают до 39 °С и засевают соответствующей микробной культурой и бактериофагом одновременно. Для засева используют 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляют из расчета 50 млн микробных клеток на миллилитр среды. Бактериофаг добавляют в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды. Среду с бактериальной культурой и фагом оставляют при температуре 37 °С на 6–18 часов. Фаги активно размножаются внутри бактериальных клеток и вызывают их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляют в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через два часа после этого фильтруют содержимое реактора через бактериальные фильтры для удаления оставшихся микробных клеток.

Полученный препарат бактериофага должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости желтого цвета. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность. Безвредность препарата проверяют путем введения животным. Например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. За животными наблюдают в течение 3–4 суток. Литическую активность бактериофага определяют титрованием в жидкой питательной среде методом Аппельмана, на плотной питательной среде — методом Отто. За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то его наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис тестовой культуры микроорганизмов.

После проведения контрольных исследований препарат разливают во флаконы нейтрального стекла. Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливать и сухие. Для их получения фаголизат осаждают сернокислым аммонием, осадок отделяют от жидкой части, добавляют к нему стабилизатор (9 % глюконат кальция), смесь тщательно растирают и лиофилизируют [31].

Биологическое значение бактериофагов

Бактериофаги играют важную роль в круговороте углерода и энергии, контроле численности микробных популяций и эволюции бактерий. Бактериофаги, будучи подвижными генетическими элементами, служат мощным фактором изменчивости бактерий. Например, они осуществляют процесс трансдукции — перенос бактериальных генов из одной клетки в другую: вырезаясь из генома одной бактерии, они могут прихватывать с собой в капсид ее гены и, инфицируя другую клетку, передавать их новому хозяину. Есть все основания предполагать, что большинство бактерий содержит профаги. Многие культуры несут 2–4 и даже более умеренных фагов, то есть являются полилизогенными. Например, многие актиномицеты и клубеньковые бактерии содержат в геноме четырех и более профагов.

Способность фагов менять фенотип бактерий путем привнесения чужеродных (и фаговых в том числе) генов может быть одновременно залогом процветания для бактерий и источником больших проблем для человечества: так бактерии могут приобретать факторы вирулентности и устойчивости — к другим фагам, антибиотикам и прочим воздействиям (если фаг, например, награждает бактерию способностью формировать биопленки) [32]. В 1951 году была описана фаговая конверсия Corinebacterium diphtheriae: оказалось, что ген tox, кодирующий дифтерийный токсин, в геном нетоксигенных бактериальных штаммов привносится умеренным фагом β. В результате коринебактерия производит сильнейший токсин, инактивирующий в человеческих клетках один из компонентов трансляционного аппарата — EF-2 (эукариотический фактор элонгации 2). Подавление синтеза белка проявляется своеобразной дифтерийной симптоматикой. Аналогичные механизмы приобретения патогенных свойств позже выявили у холерных вибрионов, сальмонелл, клостридий и др.

Лабораторное и промышленное применение бактериофагов

Способность фагов к внесению в клетку определенного количества генетического материала, упакованного в капсид, широко эксплуатируется в генной инженерии: их часто используют в качестве векторов различного назначения. Например, для создания библиотек генов нередко конструируют векторы на основе бактериофага λ, содержащего двухцепочечную ДНК. Левое и правое плечи ДНК фага содержат гены, необходимые для литического цикла, а среднюю — несущественную для размножения — часть молекулы можно заменять крупным (примерно до 24 т.п.н.) фрагментом чужеродной ДНК, включая эукариотическую. Такую рекомбинантную ДНК упаковывают в вирионы и заражают ими подходящую культуру бактерий, которая затем многократно воспроизводит фаговую ДНК с интересующими человека фрагментами.

Из-за высокой специфичности многие фаги служат диагностическими инструментами для идентификации бактериальных культур в медицинской, ветеринарной, технической микробиологии и фитопатологии. Метод фаготипирования, основанный на исключительной специфичности определенных фаговых штаммов, позволил распределить на фаготипы ряд штаммов бактерий, неотличимых друг от друга по другим признакам. Фаготипирование с успехом применяют для идентификации типов кишечной палочки, сальмонелл (включая возбудителя брюшного тифа), стафилококков и др. Этот метод дает эпидемиологам возможность отследить цепочку случаев заболевания и определить источник инфекции.

Бактериофаги прекрасно подходят для быстрого обнаружения небольших количеств патогенных бактерий во внешней среде: появляются и множатся хозяева — нарастает титр специфического бактериофага. Определение колифагов стало одним из ключевых мероприятий в санитарном контроле вод, поскольку позволяет выявить фекальное загрязнение даже при малом количестве кишечной палочки, не определяемом бактериологическими методами.

Фаги применяются и в борьбе с бактериальными вредителями различных технических брожений, и в производстве ферментов с помощью бактериальных культур. В то же время, заражая промышленные культуры, бактериофаг вредит «полезным» производственным штаммам (вакцинным, продуцентам антибиотиков, возбудителям молочнокислого, ацетонобутилового и некоторых других брожений), чем вызывает серьезные нарушения технологического процесса.

Применение бактериофагов в медицине

Первый отчет об успешной фаготерапии был опубликован в 1921 году фламандцами Р. Бранохе и Ж. Майсином, которые использовали бактериофаг для лечения кожной стафилококковой инфекции [33].

Как уже было упомянуто, западная медицина c середины ХХ века практически отказалась от использования бактериофагов в терапевтических целях [5], однако в СССР фаги довольно широко применялись. Одним из самых, пожалуй, масштабных примеров практического применения фагов является использование комплексного препарата бактериофагов в Сталинграде во время Великой Отечественной войны. З.В. Ермольева во время работы в Ташкентском институте вакцин и сывороток разработала препарат, содержащий 19 видов бактериофагов, в том числе холерный, брюшнотифозный и дифтерийный. Во время Сталинградской битвы в связи с угрозой эпидемии холеры было налажено производство холерного фага в самом Сталинграде, и препарат ежедневно принимали около 50 тысяч человек [34].

После войны в СССР приступили к промышленному производству фаговых препаратов, которое действует и в настоящее время. В России производством бактериофагов занимаются в основном филиалы НПО «Микроген»: «Иммунопрепарат» (г. Уфа), «ИмБио» (г. Нижний Новгород), «Биомед» (г. Пермь).

На данный момент в РФ зарегистрировано и производится 13 фаговых препаратов (табл. 2).

Отдельно стоит осветить вопрос применения фаготерапии в странах Запада. Как известно, после открытия антибиотиков работы, связанные с медицинским применением фагов, там были полностью свернуты. Однако в последние годы в связи с тревожной динамикой распространения внутрибольничных инфекций, резистентных к большинству известных антибиотиков, многие биотехнологические компании сделали резкий поворот к изучению возможности создания лекарств на основе бактериофагов. Однако, несмотря на существенные технологические преимущества, для создания эффективных препаратов необходима коллекция бактериофагов, действующих на клинически значимые штаммы возбудителей, и соответствующий опыт их клинического применения, чем эти компании пока не обладают.

С терапевтической целью бактериофаги применяют, например, в России, Грузии и Польше, причем самыми разными способами. Для коррекции кишечных дисбиозов жидкие препараты применяют внутрь или per rectum при помощи клизмы. Таблетированные формы принимают внутрь, возможно использование бактериофагов и в составе ректальных свечей. При кожных и раневых инфекциях их применяют в виде примочек на очаги поражения. При фарингитах, ларингитах и тонзиллитах препараты используют для орошения или полосканий, при отитах — закапывают в уши. Для лечения абсцессов в их полость вводят ватный шарик, пропитанный препаратом. Больным, страдающим хроническими остеомиелитами, препарат вводят непосредственно в пораженный участок кости. Также препараты можно вносить в брюшную, плевральную и суставные полости, а также применять в форме аэрозолей при поражениях легких. При инфекциях мочевыводящих путей бактериофаги вливают непосредственно в пораженный орган с помощью зонда. При гинекологических заболеваниях препарат вливают в матку либо применяют влагалищные тампоны, пропитанные фаговым раствором.

А еще их используют в методике под названием фаговый дисплей, которая, в частности, позволяет находить новые антитела для диагностики и терапии заболеваний: «Враг моего врага — мой друг. Как бактерии и вирусы помогают создавать антитела для лечения человека» [39]. — Ред.

Преимущества бактериофагов перед антибиотиками достаточно очевидны.

К сожалению, недостатков бактериофаги тоже не лишены.

Заключение

Прошло уже 100 лет с момента открытия бактериофагов. Неоправданно забытые на Западе и чудом сохранившиеся в России, они полвека пребывали в тени успеха антибиотиков. Но эпоха триумфа антибиотиков выявила и важнейшую проблему их активного применения — угрожающий рост резистентности к ним среди опасных патогенов, и многие ученые и врачи видят именно в фагах альтернативу антибиотикам. Если на сегодняшний день мы имеем штаммы бактерий, устойчивые даже к антимикробным препаратам «последней надежды», то фаги, благодаря описанным выше механизмам коэволюции с бактериями, никогда не утратят актуальности. За 100 лет они были детально изучены, признаны безопасными и стали незаменимым инструментом в генетике и биоинженерии, санитарной микробиологии и эпидемиологии, промышленности, медицине и даже в космической сфере (да-да, бактерии с профагом используют для оценки защиты обшивки космических кораблей от радиации). И как нельзя лучше характеризует значение фагов для человека древняя пословица: «Враг моего врага — мой друг».

Источник